专利名称:Rt-pcr检测鸭源性冠状病毒的引物及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒的分子生物学检测技术，具体涉及一种RT-PCR检测鸭源性冠状 病毒的引物及试剂盒。
背景技术：
禽传染性支气管炎(IB)是由冠状病毒科的禽传染性支气管炎病毒(IBV)引起的 一种常见多发的急性高度接触性传染病，表现为呼吸型、肾型、肠型、腺胃型等多种病型。该 病可感染所有日龄的鸡，导致生长迟缓、死亡、增重和饲料报酬降低。IBV往往引起复合感 染，如新城疫(Newcastle Disease, ND)、慢性呼吸道病(CRD)等，并可继发细菌性疾病，如 大肠杆菌病、沙门氏菌病等，从而加重了对鸡群的危害。据《世界家禽》1999年资料，全世界 的禽病中，以呼吸系统疾病最为严重，其中IB是世界大多数地区危害养鸡业的主要疾病。 1988年以来，IB在我国大部分地区相继流行，疫区的发病率可达100%，死亡率可达10 30%。由于鸡传染性支气管炎的血清亚型众多，病毒的变异性强，给临床诊断和防制带来了 重重困难。常规的病毒分离鉴定、琼脂扩散试验等检测手段费时费力，而且敏感性不强，无 法满足需要。因此建立快速而又有效地检测方法就尤为关键。
2004年5月，河南省郑州某养殖场发生了以腹泻和生长迟缓为主要症状的疑似 IB疾病，感染鸡主要表现精神沉郁，下痢，生长缓慢及抵抗力下降，发病率为100%，死亡率 达10%以上，感染鸡群的生产性能显著降低。调查中显示，与鸡舍相距仅150m左右处有一 个1700只的肉鸭群，在第一批鸡发病前约10天左右鸭群发生过类似症状的疾病，但没有造 成大量死亡。死亡鸡病变主要为小肠出血，肠壁变薄，有的有溃荡，小肠绒毛脱落，腺胃乳 头肿大、粘膜脱落，有的肌胃和腺胃交界处有出血，肌胃有出血或溃荡，肾脏肿大，呈“花斑 肾”，肺脏无明显变化，法氏囊、胸腺等免疫器官萎缩；病鸭剖检以肾脏肿大，苍白兼有出血、 腿肌及肝脏出血为主要特征。在同地区的其他鸡场也发生了同样症状的疾病，虽然经过多 种IBV疫苗的免疫但疫情未得到有效控制。河南科技学院动物科学学院开展了对该疫病的 研究工作，结果从发病鸭体内分离到一株病毒，鉴定为IBV，命名为鸭源性冠状病毒^2004 株(保藏编号为CGMCC NO. 3842)，其专利文献公开号为CN 101906404A，此为首次有关家鸭 感染IBV的报道。该病毒分离株U2004来自鸡鸭混养的养殖场，其不仅引起鸡的大批发病 及死亡，还感染了鸭群，严重影响了家鸭的生长发育并导致鸭的死亡。与其它禽类的冠状病 毒相比，鸭源性冠状病毒^2004变异的程度较大，对动物的感染谱更广。对于该病毒，目前 还缺乏快速有效的分子生物学检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是一种针对鸭源性冠状病毒U2004毒株的RT-PCR检测 引物及试剂盒，该方法特异性强，灵敏度高，操作简单，所需时间短，可以对大量的样品进行 检测。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的引物，其核苷酸序列如下 上游引物5，-GTTGTGGATGCTTTGGTATC-3，(23749-23768)，如 SEQ ID N0:2 所示， 下游引物5，-GCTACAAACCCACAAAAGAC-3，(24269-24288)，如 SEQ ID NO: 3 所示。
与所述RT-PCR检测引物相对应的鸭源性冠状病毒U2004的DNA特征片段的核苷 酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
所述上游引物和下游引物对鸭源性冠状病毒U2004株RT-PCR扩增出约540bp的产物。
上述RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的引物在对鸭源性冠状病毒U2004的鉴别和检 测中的应用。
一种RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的试剂盒，含有上述的所有引物。
以单样份计量(即检测一个禽只样或待测样的用量)，上述RT-PCR检测鸭源性冠状 病毒的试剂盒的RT-PCR反应体系中含有
ddH20 18. 25 μ L、40ymol/L 的 dNTP Mixture lyL、10XPCR Buffer (Mg2+) 2· 5 μ L、 2. 5pmol/L 的上游引物 F1O. 25 μ L、2. 5pmol/L 的下游引物 F2 0. 25 μ L、5U/ μ L rTaq 0. 25 μ L，且检测时使加入待测样液后的RT-PCR反应体系总体积为25 μ L。
所述待测样液的制备方法如下
(1)待测样品处理取相应的组织器官，剪碎放入无菌离心管中，按Ig:5mL的比例加入 经高压灭菌PBS缓冲液，-20°C下反复冻融2 3次，IOOOrpm离心5 8min ；弃沉淀，取上 清于另一支无菌离心管中，SOOOrpm离心8 12min ；弃沉淀，取上清于另一无菌离心管中， 12000rpm离心8 12min ；弃沉淀，取上清于另一无菌离心管中，用0. 22 μ m的滤器过滤，得 滤液；
(2)RNA的提取用RNA提取试剂取待测样品的RNA，再进行一步法反转录反应，反 转录第一步，dNTP Mixture (IOmM each) 1 μ L、下游引物 1 μ L、上步所得 ^Template RNA8 μ L瞬间离心混合均勻，反应条件为65°C 5min，4°C保存；反转录第二步，上述变性退 火反应液 10μ L、5XPrimeScript Buffer 4μ L>40 U / μ L RNase Inhibitor 0. 5 μ L、 PrimeScript RTase (for 2 step) 0. 5 μ L、RNase Free ddH20 5 μ L 瞬间离心混合均勻， 反应条件为 30°C、10min，42°C、30min，95°C 5min，4°C保存。
以所述试剂盒对待测样液进行热盖方式RT-PCR扩增时的反应条件为瞬间离心 混合均勻，95 °C、3min，(95°C > Imin ；57 °C、lmin，72°C、lmin，35cycle. ),2°C 10min，4°C、 pause。
上述RT-PCR扩增后所得PCR产物在通过1%琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结束后用 凝胶成像系统分析，在540bp处出现特异条带，说明样品带鸭源性冠状病毒ZZ2004，反之， 则不携带该鸭源性冠状病毒ZZ2004。
本发明具有积极有益的效果
本发明利用PCR技术，通过RNA的提取，cDNA的制备，反应条件的优化，建立了 RT-PCR 检测方法及相应的检测试剂盒，该试剂盒特异性强，灵敏度高，重复性好，操作简单，快速， 克服了 ELISA法需制备抗血清的限制且灵敏度不高、易出现假阳性的缺点；本发明为鸭源 性冠状病毒感染禽类提供了一个很好的分子生物学诊断方法，对于鸭源性冠状病毒的检测 和IB预防具有重要的现实意义。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中的试验方法，如无特别说 明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料及试剂，如无特别说明，均购自常规生化 试齐Ll商店。
实施例1 :RT-PCR检测方法的建立
(1)待测样品处理取相应的组织器官1. Og (如气管、心脏、肾脏等)，放入1. 5mL灭菌 离心管中剪碎，加入经高压灭菌PBS缓冲液，加入比例为1 :5，-20°C反复冻融3次，IOOOrpm 离心5min ；弃沉淀，取上清于另一支1. 5mL灭菌的离心管中，8000rpm离心IOmin ；弃沉淀， 取上清于另一支1.5mL灭菌的离心管中，12000rpm离心IOmin ；弃沉淀，取上清于另一支 1. 5mL灭菌的离心管中，用0. 22 μ m的滤器过滤，即可。
(2)标准病毒的制备
将鸭源性冠状病毒U2004毒株接种于10日龄SPF鸡胚，0. 2mL/胚，同时做空白对 照，37°C人工孵化7 后，分别收集病毒尿囊液和空白尿囊液，于-20°C冰箱保存。取病毒 尿囊液和空白尿囊液各1. 5mL，8000rpm离心5min，取上清，12000rpm离心15min，取上清， 于-20°C冰箱保存
(3)引物的设计与合成
根据CSISV全基因序列(引物位于23749力似88)，设计一对特异性引物，其序列为 上游引物5，GTTGTGGATGCTTTGGTATC3，(23749-23768) 下游引物5，GCTACAAACCCACAAAAGAC3，(24269-24288)，
所扩增产物大小为^Obp，横跨S、3a、!3b及E基因，由北京赛百盛生物工程公司合成，用 DEPC处理水稀释到20pmoL/ μ L，_20°C保存备用。
(4) RNA 的提取
用 DNA/RNA 提取试剂盒(MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 3· 0)提取 RNA,参照试剂盒说明书进行。
(5)cDNA 的制备
采用两步法反转录反应，反应体系为20 μ L 反转录第一步
dNTP Mixture (IOmM each)1 μ L
下游引物IyL
上述 Template RNA8μ L
总体积IOyL 瞬间离心混合均勻，反应条件为65°C 5分钟，4°C保存 反转录第二步
上述变性、退火反应液10 μ L
5XPrimeScript Buffer4μ L
RNase Inhibitor (40 U /μ L)0. 5 μ L
PrimeScript RTase (for 2 step)0. 5 μ LRNase Free ddH905 μ L
总体积
瞬间离心混合均勻，反应条件为30°C (6 ) RT-PCR反应体系的建立 PCR反应体系如下 (MH2O
dNTP Mixture (40ymol/L) 10XPCR Buffer (Mg2+ ) 上游引物(2. 5pmol/L) 下游引物(2. 5pmol/L) rTaq(5U/μ L) cDNA
20 μ L
IOmin，42°C、30min，95°C 5min, 4°C保存。
18. 25 μ L
1 μ L 2. 5μ L 0. 25 μ L 0. 25 μ L 0. 25 μ L 2. 5μ L
总体积25 μ L
瞬间离心混合均勻，采用热盖方式进行PCR扩增反应。
反应条件为95°C、3min，(95°C、Imin ；57 °C、lmin，72 °C、lmi，35 cycle. ),72 °C IOmin,4°C、pause。
将上述反应体系中相应的引物、酶、dNTP、Mg2+等分别按比例进行混合(即将可以 混合的成分都预先混合好)，并包装，即制成便于使用的商品化的试剂盒。在该试剂盒中还 可设置相应的阴性对照、阳性对照。
将上述RT-PCR扩增后所得PCR产物在通过1%琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结束后 用凝胶成像系统分析，在MO bp处出现特异条带，说明样品带鸭源性冠状病毒ZZ2004，反 之，则不携带该鸭源性冠状病毒ZZ2004。
实施例2 =RT-PCR检测方法对样品进行检测
取人工感染鸭源性冠状病毒^2004株的鸡的不同感染时段的肾脏、气管和心脏，共计 21份样品，按照实施例1所建立方法和试剂盒进行RNA的提取、cDNA的制备和PCR的扩增， 结果有20份样品扩增到与预期大小相符合的目的片段，其检出率为95%，参见表1。
表1人工感染组织中病毒ZZ2004检测结果
权利要求
1.一种RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的引物，其核苷酸序列如下上游引物5，-GTTGTGGATGCTTTGGTATC-3，，下游引物5，-GCTACAAACCCACAAAAGAC-3，。
2.根据权利要求
1所述的RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的引物，其特征在于，与所述 RT-PCR检测引物相对应的鸭源性冠状病毒U2004的DNA特征片段的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
3.根据权利要求
1所述的RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的引物，其特征在于，所述上游 引物和下游引物对鸭源性冠状病毒U2004株RT-PCR扩增出约MObp的产物。
4.权利要求
1所述的RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的引物在对鸭源性冠状病毒U2004 的鉴别和检测中的应用。
5.一种RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的试剂盒，其特征在于，含有权利要求
1所述的所 有引物。
6.根据权利要求
5所述的RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的试剂盒，其特征在于，含有 RT-PCR反应体系，以单样份计量，该RT-PCR反应体系包括ddH20 18. 25 μ L、40ymol/L 的 dNTP Mixture 1 μ LUO XPCR Buffer Mg2+ 2· 5 μ L、 2. 5pmol/L 的上游引物 F1 0. 25 μ L、2. 5pmol/L 的下游引物 F2 0. 25 μ L、5U/ μ L rTaq 0. 25 μ L，且检测时使加入待测样液后的RT-PCR反应体系总体积为25 μ L。
7.根据权利要求
6所述的RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述待 测样液的制备方法如下(1)待测样品处理取相应的组织器官，剪碎放入无菌离心管中，按Ig:5mL的比例加入 经高压灭菌PBS缓冲液，-20°C下反复冻融2 3次，IOOOrpm离心5 8min ；弃沉淀，取上 清于另一支无菌离心管中，SOOOrpm离心8 12min ；弃沉淀，取上清于另一无菌离心管中， 12000rpm离心8 12min ；弃沉淀，取上清于另一无菌离心管中，用0. 22 μ m的滤器过滤，得 滤液；(2)RNA的提取用RNA提取试剂取待测样品的RNA，再进行一步法反转录反应，反转 录第一步，dNTP Mixture 1 μ L、下游引物1 μ L、上步所得Template RNA8yL瞬间离心混 合均勻，反应条件为65°C 5min，4°C下保存；反转录第二步，上述变性退火反应液10 μ L、 5XPrimeScript Buffer 4μ L.40 U /μ L RNase Inhibitor 0. 5 μ L, PrimeScript RTase for 2 step 0· 5 μ L、RNase Free ddH20 5 μ L瞬间离心混合均勻，反应条件为 30°C、10min，42°C、30min，95°C 5min，4°C保存。
8.根据权利要求
6所述的RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的试剂盒，其特征在于，以所述 试剂盒对待测样液进行热盖方式RT-PCR扩增时的反应条件为瞬间离心混合均勻，95 °C、 3min，(95DC、lmin ；57。C、lmin，72。C、lmin，35cycle. ), 2°C lOmin，4。C、pause。
9.根据权利要求
8所述的RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述 RT-PCR扩增后所得PCR产物在通过1%琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结束后用凝胶成像系统分 析，在540bp处出现特异条带，说明样品带鸭源性冠状病毒ZZ2004，反之，则不携带该鸭源 性冠状病毒ZZ2004。
专利摘要
本发明涉及一种RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的引物及试剂盒。其上、下引物的核苷酸序列依次为5'-GTTGTGGATGCTTTGGTATC-3’、5'-GCTACAAACCCACAAAAGAC-3’，并建立起含有上述引物的荧光定量RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的试剂盒，该试剂盒特异性强，灵敏度高，重复性好，操作简便，快速，效率高，成本低，克服了ELISA法需制备抗血清的限制且灵敏度不高、易出现假阳性的缺点，可对大量的样品进行检测，能够极短时间内为IB的治疗及预防治疗提供决策依据。
文档编号C12Q1/70GKCN102140559SQ201110103532
公开日2011年8月3日 申请日期2011年4月25日
发明者刘兴友, 刘明成, 王丽荣, 胡建和 申请人:河南科技学院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan