一种乳腺癌检测质控品及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种乳腺癌检测质控品及其制备方法，尤指一种用于肥R2基因扩增 FISH检测的质控物及其制备方法，属于临床检验学、病理学和生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率呈逐年上升的趋势。原癌基因 肥R2(人类表皮生长因子受体2基因）是当前研究的热点之一。有资料显示，大约20-30% 的乳腺癌浸润性导管癌中有肥R2基因的过表达。大量研究证实，肥R2基因扩增不仅与乳 腺癌的发生、发展及预后密切相关，而且对药物治疗方案的选择也至关重要。
[0003] 肥R2阳性的乳腺癌对常规的化疗和内分泌治疗反应差，肿瘤浸润性强，无病生存 期短，预后差。为此，多种阻断肥R2的抗癌药物相继问世，其中曲妥珠单抗是一种重组DNA 衍生的人源化单克隆抗体，选择性地作用于肥R2的细胞外部位，适用于治疗肥R2过度表达 的乳腺癌。由于只有肥R2蛋白过度表达和基因扩增的乳腺癌患者接受曲妥珠单抗治疗才 有效，因此准确评价肥R2基因和蛋白水平对治疗至关重要。
[0004] 检测肥R状态的方法有；对于肥R2/neu共表达产生的蛋白水平的免疫组化，单拷 贝和双拷贝的FISH (巧光原位杂交）、CISH(显色原位杂交）W及SISH(银增强原位杂交）。 对于肥R2基因扩增的FI甜检验是检测肥R2状态的金标准，根据ASCO/CAP的指南标准，对 于免疫组化检测积分为化的标本，必须使用FI甜检测进行验证，W避免出现假阳性的可 能。然而对于该种方法来说，一个好的质控品是保证检测的准确度的关键。传统上的质控 品倾向于使用乳腺癌患者的组织样本作为检测质控品，但是该种质控品来源局限，一致性 较差，在应用的过程中存在较大的局限性。此外，患者来源的质控品只能随机测定肥R2阳 性与阴性，无法特定地反映出肥R2基因表达水平W及多体造成的假阳性。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种来源广、易于获得、一致性好的乳腺癌检测 质控品。
[0006] 本发明要解决的另一个技术问题是提供该种乳腺癌检测质控品的制备方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用W下技术方案：
[000引一种乳腺癌检测质控品，是用乳腺癌细胞系通过福尔马林固定，石蜡包埋，切片烤 片后制作成标本切片。
[0009] 所述乳腺癌细胞系选自MCF-7细胞系、MDA-MB-453细胞系和S邸R-3细胞系中的 一种或几种。
[0010] 本发明采用体外培养的乳腺癌细胞系制作的质控品，可W替代真实组织样本制 作的质控品。我们研究了多种已经公开的乳腺癌细胞系，发现乳腺癌细胞系SKBR3和 MDA-MB-453可W表达肥R2基因的扩增，而细胞系BT-20、MBA-MD-175和MDA-MB-231则检 测不到扩增或者检测量低。MCF-7是阴性细胞，其肥R2基因水平和正常人一致，基本为一 条染色体上有一个肥R2基因。发明人通过比较细胞系S邸R3和MCF-7，发现S邸R3细胞系 和MCF-7细胞系相比能表现几乎10倍的基因扩增W及15倍的肥R2蛋白的表达。发明人 对于使用的细胞系通过PCR方法验证肥R2基因水平，结果显示本发明所选择的细胞系能精 确地显示肥R2基因水平的梯度变化。因此我们筛选出肥R2基因和肥R2蛋白表达水平存 在不同差异的特定细胞系，通过该些体外培养的乳腺癌细胞系制作质控品，可W对肥R2基 因的不同表达水平做出区分。
[0011] 所述MCF-7细胞系还包括多体MCF-7细胞系。
[0012] 所述多体MCF-7细胞系是MCF-7细胞系经秋水仙素处理得到。我们使用秋水仙素 处理MCF-7细胞系，使细胞分裂周期停留在分裂中期，造成细胞染色体形成2倍的现象，制 作乳腺癌细胞系假性多体的细胞系。由于在细胞培养过程中的细胞多为二倍体细胞，并不 能特异地选择出多体细胞，该种方法得到的假性多体细胞弥补了该个缺点。
[0013] 所述的乳腺癌检测质控品，优选是用培养的MCF-7细胞系、MDA-MB-453细胞系、 S邸R-3细胞系和多体MCF-7细胞系分别制作的标本切片。也可W是多体MCF-7细胞系制作 的标本切片与上述任意一种或多种细胞系制作的标本切片的组合。该质控品能够模拟乳腺 癌病理组织的肥R2基因不同表达水平W及多体的情况。
[0014] 一种乳腺癌检测质控品的制备方法，包括W下步骤：
[0015] (1)培养乳腺癌细胞系；取乳腺癌细胞系体外培养至1〇7?108数量级并处于对数 生长期；
[0016] (2)制备多体细胞系：取MCF-7细胞系体外培养至1〇7?10 8数量级并处于对数生 长期，加入秋水仙素，培养2-4小时，形成多体MCF-7细胞系；
[0017] (3)制作质控品切片；收集对数生长期的乳腺癌细胞系和多体MCF-7细胞系，经过 固定、脱水、透明化处理、石蜡包埋、切片，制成质控品切片。
[0018] 所述步骤（1)和（3)中的乳腺癌细胞系选自MCF-7细胞系、MDA-MB-453细胞系和 S邸R-3细胞系中的一种或几种。
[0019] 所述步骤（3)的固定是指每种细胞分别加入15ml 10%中性甲醒固定细胞1小时 后lOOOr 5min离屯、，弃上清，加入1XPBS冲洗细胞3次。
[0020] 所述步骤做的脱水是指加入80%己醇15ml，静置10min后 1500r5min离心弃 上清；加入90%己醇15ml，静置lOmin后1500r 5min离屯、，弃上清；加入95%己醇15ml， 静置lOmin后1500r 5min离心弃上清；加入无水己醇15ml，静置15min后1500r 5min离 屯、，弃上清；加入无水己醇15ml，静置15min后1500r 5min离屯、，弃上清。
[0021] 所述步骤（3)的透明化处理是指加入无水己醇和二甲苯的混合液（体积比 静置 lOmin 1500r 5min 离屯、，弃上清；加入二甲苯 7ml 静置 10min，1500r 5min 离 屯、，吸去6ml上清；吹打混匀将细胞悬液转移到1. 5ml EP管中，150化5min离屯、尽量吸干 净上清；
[0022] 所述步骤（3)的石蜡包埋是指70°C融化石蜡，将融化的500ul液体石蜡分别加入 到每种细胞团中，吹打混匀后，吸出到包埋盒（约500ul);再次灌蜡包埋；
[002引所述步骤（3)的切片是指4 ym/张切片，切片后于恒温37°C水箱内展片，用载玻片 撰片，惊干，置于70 °C温箱烤片化。
[0024] 发明人对于得到的切片标本通过金菩嘉、安必平公司试剂盒进行检测验证；对于 得到的切片标本通过免疫组化的方法进行检测验证。FI甜实验和免疫组化结果分别从基因 和蛋白两方面证明我们制作的质控品达到了预期的阴阳性梯度和多体的目标。
[0025] 本发明筛选得到了S种肥R2基因和肥R2蛋白表达水平存在不同差异的细胞系培 养到细胞数量达到1〇7?1〇8/蜡块，同时使用秋水仙素处理MCF-7细胞系，使细胞分裂周期 停留在分裂中期，造成细胞染色体形成2倍的现象，制作乳腺癌细胞系假性多体的细胞系。 之后将上述细胞系通过福尔马林固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋制作乳腺癌细 胞系蜡块，对蜡块进行4 y m切片，烤片，制作能用于肥R2基因扩增FI甜检验的质控品。该 种通过细胞系制作的质控品来源丰富，重复性和一致性高，同时能够人为控制和选择所需 的肥R2基因扩增水平的质控品，克服了传统质控品的不足。通过细胞系制作的质控品操作 简便，试验周期短，能够大批量生产。本研究制作的质控品能够作为乳腺癌个体化检测的质 控品，用于室内质量控制（IQC)和室间质量评价巧QA)，并且具用较好的重复性和一致性。
[0026] 本发明的乳腺癌细胞系质控品可W长期保存在大多数的温度条件下，在室温和 4°C环境保存两周后检测效果无变化。因此，我们得到的切片质控品可W用于EQA和IQC，在 将切片质控品作为EQA评估试验的质控品发放的时候，它可W在室温下无需冰袋进行邮寄 并能长时间保存在-20°C或者-4°C条件下。
[0027] 本发明的优点是：本发明采用体外培养的乳腺癌细胞系制作的质控品，可W作为 真实组织样本制作的质控品的替代品，样本量大、重复性高，并且通过选择不同细胞系可W 完成不同肥R2基因水平的检测，制作方法简便，能够批量生产，易于保存，可用于室内质量 控制和室间质量评价。
[002引下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步叙述，W便公众对
【发明内容】
有更 深入的了解，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换， 均属于本发明的保护范围。
【附图说明】
[0029] 图1为S种细胞肥R2目的基因和内参基因GAPDH同时进行实时巧光定量PCR的 曲线图，其中基线为绿色标记线。
[0030] 图2为细胞系制作切片的细胞分布示例情况，图2上为10倍物镜下观察结果，图 2下为40倍物镜下观察结果。
[0031] 图3为安必平公司试剂盒检测四种切片标本的巧光示意