0015](b) 200 UL 1.0 X 1(T4 M鲁米诺和200 μ L 0.02 mg/mL甲胎蛋白二抗加入到活化了的磁性微球中，置于恒温箱中37 ° C温育12小时，经0.0lM pH=7.4磷酸缓冲溶液洗涤后，加入200 UL 0.1%牛血清白蛋白溶液37 ° C温育2小时，经0.0lM pH=7.4磷酸缓冲溶液洗涤、磁性分离后得到鲁米诺功能化的磁性免疫探针。
[0016]鲁米诺溶液:用0.05 M碳酸盐缓冲溶液(pH 10.3)配制0.1M溶液，放置三天，再用0.1 M NaHC03-Na0H缓冲溶液(pH 10.0)稀释为0.0lM储备液，使用时用0.01 M pH7.4磷酸缓冲溶液逐级稀释至所需浓度。
[0017]0.0lM pH 7.4 磷酸缓冲溶液:称取 8.20 g NaCl、0.20 g KCl、3.64gNa2HPO4* 12Η20、0.24 g KH2PO4，蒸馏水溶解、调 pH=7.4，定容至 1.0 L。
[0018](2)制备甲胎蛋白一抗修饰的金电极。
[0019](a)金电极依次使用1.0 Mm,0.3 Mm和0.05 Mm的a-Al2O3抛光粉抛光，用二次蒸馏水洗涤干净。
[0020](b)将抛光的电极浸到200 UL 1.0 X 1(Γ4Μ巯基乙酸37 ° C温育24小时，经0.0lM pH=7.4磷酸缓冲溶液洗涤后，浸入200 μ L 0.1 M的1-(3-二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺和0.1 M的N-羟基琥珀酰亚胺溶液37 ° C孵育5小时，经0.01 M pH=7.4磷酸缓冲溶液洗涤得到活化了羧基修饰金电极。
[0021](c)将活化了的金电极浸入200 UL 0.02 mg/mL甲胎蛋白一抗溶液中，37 ° C温育12小时，经0.01 M pH=7.4磷酸缓冲溶液洗涤，浸入200 μ L 0.1%牛血清白蛋白溶液37 ° C温育2小时，经0.01Μ ρΗ=7.4磷酸缓冲溶液洗涤后得到甲胎蛋白一抗修饰的金电极。
[0022]实施例2
电致化学发光检测甲胎蛋白(见图2)
(I)按照实施例1制备鲁米诺功能化的磁性免疫探针。
[0023](2)按照实施例1制备甲胎蛋白一抗修饰的金电极。
[0024](3)在甲胎蛋白一抗修饰的金电极表面滴加8 μ L待测样品或标准品，37 ° C温育2小时，经0.01 M ρΗ=7.4磷酸缓冲溶液洗涤，滴加鲁米诺功能化的磁性免疫探针溶液，37 ° C温育2小时，在金电极表面形成一抗/抗原/ 二抗/鲁米诺夹心式结构。
[0025](4)电致化学发光检测。将制备好的金电极浸入到2.0 mL电致化学发光反应试剂中，以铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，测定其发光强度。利用所构建的方法检测一系列浓度甲胎蛋白标准品，其工作曲线如图3所示。
[0026]实施例3
按照实施例1和实施例，利用本方法制备的鲁米诺功能化的磁性免疫探针，对5份人血清样品中的甲胎蛋白进行检测，结果与传统的酶联免疫法对照，绘制相关曲线。结果表明二者具有很好的相关性(见图4)。
【主权项】
1.在一种鲁米诺功能化的磁性免疫探针，由羧基修饰的磁性微球与鲁米诺、甲胎蛋白二抗链接而成。
2.根据权利要求1所述的鲁米诺功能化的磁性免疫探针，其特征在于:所述鲁米诺、甲胎蛋白二抗分别通过氨基和羧基反应共价链接在所述的磁性微球表面。
3.根据权利要求1所述的鲁米诺功能化的磁性免疫探针，其特征在于:所述鲁米诺功能化的磁性免疫探针具有电致化学发光特性。
4.权利要求1至3中任一所述的鲁米诺功能化的磁性免疫探针的制备方法，包括如下步骤: (1)将洗涤干净的磁性微球加到1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中，搅拌状态下得到活化的磁性微球； (2)将步骤(I)得到的活化的磁性微球洗涤干净，加到鲁米诺和甲胎蛋白二抗的混合溶液中，混合均匀后孵育，洗涤干净，并用牛血清白蛋白封闭得到鲁米诺功能化的磁性微球免疫探针。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述磁性微球浓度为；1-(3_二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺浓度为0.1 M ；N-羟基琥珀酰亚胺浓度为0.1 M ;鲁米诺浓度为1.0X 10-4 M ;甲胎蛋白二抗浓度为0.02 mg/mL。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述方法还包括将所述磁性微球通过磁性分离洗涤的步骤。
7.根据权利要求4(I)和6所述的磁性微球，其特征在于:用0.1M咪唑-盐酸缓冲溶液(pH=7.0)洗涤三遍。
8.根据权利要求4(2)和6所述的磁性微球，其特征在于:用0.0lM磷酸缓冲溶液(ρΗ=7.4)洗涤三遍。
9.一种基于鲁米诺功能化磁性免疫探针检测甲胎蛋白的方法，步骤包括: (1)利用Au-S化学键，在金电极表面修饰巯基乙酸； (2)在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的作用下，将巯基乙酸修饰的金电极与甲胎蛋白一抗反应，并用封闭液封闭，制备甲胎蛋白一抗包被的金电极； (3)将步骤9(2)中制备的甲胎蛋白一抗包被的金电极依次与甲胎蛋白抗原标准品或标本、鲁米诺功能化的磁性微球免疫探针； (4)在检测池中加入电致化学发光反应试剂； (5)将步骤9(3)制备的金电极插入到检测池中，电致化学发光仪测定电致化学发光强度。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于:步骤9(I)中金电极为4 mm金盘电极，巯基乙酸浓度为1.0 X10_4 Mo
11.根据权利要求9所述方法，其特征在于:步骤9(2)中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺浓度为0.1 M，N-羟基琥珀酰亚胺浓度为0.1 M，甲胎蛋白一抗浓度为0.01 mg/mL，封闭液为0.1% (m/v)牛血清白蛋白溶液。
12.根据权利要求9所述方法，其特征在于:步骤9(4)中电致化学发光反应试剂中过氧化氢浓度为:1.0 X I(T3 Mo
【专利摘要】本发明提供了一种基于鲁米诺功能化的磁性免疫探针检测甲胎蛋白的方法，属于纳米功能材料、生物传感技术和电化学技术领域。磁性微球比表面积大、导电能力强，且分离方便。制备鲁米诺功能化的磁性微球，利用其标记甲胎蛋白二抗，从而制得鲁米诺功能化的磁性免疫探针。在金电极表面构建“甲胎蛋白一抗/甲胎蛋白抗原/鲁米诺功能化的磁性免疫探针”式复合结构，通过检测电致化学发光信号实现对甲胎蛋白抗原的灵敏、特异性检测。目前常采用的酶标记抗体法，其探针制备操作复杂且易降低酶的活性。与之比较，本发明中鲁米诺功能化的磁性免疫探针标记抗体制备简单方便、且易于保存，可用于检测甲胎蛋白抗原。
【IPC分类】G01N33-68, G01N33-553, G01N21-76
【公开号】CN104677889
【申请号】CN201510058853
【发明人】李雪梅, 郭英姝, 张书圣
【申请人】临沂大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月5日