的荧光成像方法
【专利说明】一种活细胞中稀土离子La3+、Lu3+的荧光成像方法 技术领域
[0001] 本发明属分析化学领域，具体地说是利用杯芳烃荧光探针用于活细胞中稀土离子 La3+、Lu3+的荧光成像方法。 【背景技术】
[0002] 稀土在我国储量占世界首位，已大量用于农作物增产、畜牧业、养殖业微量添加 剂、工业生产、生物及医学领域。稀土微肥具有对农作物的增产作用，在我国得到广泛的应 用。随着稀土在农业、畜牧业和医药领域的大量使用，稀土离子不可避免地会随食物链进人 到人体，因此稀土离子与生物体的相互作用也日益受到人们的关注。由于生物体系的复杂 性，稀土离子与它们相互作用的过程也是相当复杂的，作用机理也不甚清楚，有关稀土进人 生物体内是否有毒仍然存在争议。有文献报道，稀土离子可以和生物体内的一些酶系相互 作用，影响它们的活性和生物体的代谢过程。稀土元素在生物学方面的效应及机理研宄指 出，稀土可促进种子萌发和根系生长，增进座花座果率，提高作物硝酸还原酶，固氮酶，淀粉 酶，蛋白酶，脂肪酶，过氧化物酶和酯酶等活性及土壤酶的活性，促进作物新陈代谢。施用稀 土能改善和增强光合器官的结构，功能和活性，大大加强了光合产物的产出和向结实器官 的转运。稀土可使蛋白质，氨基酸，维生素，油料作物的含油量，抗逆性和糖酸比增加。可 使植物吸收波长更短的辐射能，为光合提供更多的能量。自由基和超氧化物歧化酶的平衡 在生物代谢中具有重要的作用。微量铈离子可清除大量氧自由基；稀土氨基酸配合物和稀 土其他形式的配合物均具有抑菌或杀菌的作用；稀土离子及其含氮大环配合物有催化断裂 的作用，在医学和遗传工程上有重要意义；高浓度稀土和腺苷三磷酸配合物分子中原子的 活性标度变化使得该配合物对激酶类有强的抑制作用而影响代谢过程。然而，在细胞内发 生上述作用的前提是稀土离子能透过细胞质膜进入细胞，因此，关于稀土离子能否进入动 植物细胞的研宄必然成为稀土生物效应研宄的重点。细胞信使物质一般认为包括胞内游离 Ca2+、肌醇三磷酸、二酰甘油、环腺苷酸和环脲苷酸等。细胞在受到稀土离子作用时胞内信 使物质必定会发生变化。钙调蛋白是广泛存在于真核细胞中的一种多功能的调节因子，它 通过生物体内的钙离子介导参与许多的细胞代谢调控过程，在细胞代谢过程中发挥着重要 的作用，调节着近三十余种酶的活性，调节更为广泛的生理功能及基因表达。存在于生物体 内的钙调素与Ca 2+的结合并不专一，许多二价与三价的金属离子如稀土离子由于离子半径 /电荷性质及配位化学性质等方面与Ca 2+有相似之处，能够在一定程度上取代Ca 2+，在钙调 素中与Ca2+产生竞争结合并发挥一定的作用。红细胞是人体中最简单也最有代表性的膜系 统，稀土能否通过红细胞膜意义重大，但至今有关这方面的研宄仍无定论。大多数的研宄者 认为稀土离子不能进入人红细胞，只是在膜表面起作用。倪嘉缵研宄组利用ICP-MS及NMR 技术研宄了稀土离子和兔红细胞的作用，得出稀土离子不能进入红细胞的结论；但王夔研 宄组应用激光扫描法研宄指出，稀土离子能进入红细胞，其跨膜与稀土离子在膜上的打洞 作用有关。荧光指示剂法对稀土离子跨红细胞膜的研宄，能检测不同浓度稀土离子的跨膜 行为，以及稀土离子对钙内流的作用。
[0003] 活细胞成像技术是生命科学领域重要的研宄手段，可以解释活细胞中的多种生命 和生理现象。随着生命科学的发展，对细胞内的活性物种、细胞信号传导及细胞凋亡等方面 的信息研宄越来越深入。荧光成像分析是目前广泛应用于活细胞分析的一种高灵敏的可 视化分析技术。目前用于活细胞成像分析的荧光探针多为有机小分子荧光染料，在实际应 用中，这些有机荧光染料分子存在着荧光寿命较短、容易猝灭、生物相容性及稳定性差的缺 点。实现长时间、实时、动态连续测定，提高可视化分析的选择性和精确度是迫切需要解决 的问题。
[0004] 近年来，随着生命科学的不断发展，人们对细胞内的活性物种、细胞信号传导及细 胞凋亡等方面的研宄越来越深入。荧光成像分析是目前广泛应用于活细胞分析的一种有效 的可视化分析技术。稀土配合物荧光探针由于具有荧光寿命长、发射峰窄和Stokes位移大 等发光性质，引起了人们的重视与关注。目前稀土配合物荧光探针由于其优越的光学特性 已被应用到生命科学研宄的各个领域，包括荧光免疫分析、酶活性测定、核酸测定等。近年 来，随着新型的水溶性稀土配合物不断的被合成出来，稀土配合物荧光探针得到了更广泛 的应用，尤其在荧光成像方面越来越显示出它的优越性。稀土配合物独特的发光特点与先 进的光学成像技术相结合，为实时在线动态监测细胞内的分子提供了有力的实验手段，为 揭示细胞内小分子物种与生物大分子的生理功能与人类疾病的关系提供了新技术与新方 法，结果将有力的促进生命科学的发展。设计新型的稀土荧光探针，提高其水溶性、膜穿透 性、选择性以及长激发波应用于细胞内活性小分子物种检测；研宄探针穿膜机理及在细胞 内的分布情况，为探针的设计提供理论支持；利用时间分辨等荧光显微成像技术实现细胞 内分子事件的实时观测和动态研宄，对细胞生物学、组织学以及光子学成像研宄有重要影 响。
[0005] 杯芳烃是一类新型大环化合物，以经典杯芳烃为先导已发展出氧杂杯芳烃、硫杂 杯芳烃等新型化合物。以杯芳烃为分子平台，研制出各种荧光探针化合物。杯芳烃化合物 已应用于很多领域，包括阴/阳离子配合物的传感、污染修复和催化等。杯芳烃应用在生物 体系，包括可用于模拟离子通道、模拟酶、蛋白质表面识别，用于核磁共振成像试剂平台、给 药系统、固体脂质纳米粒子和抗菌剂等。杯[4]芳烃衍生物在限制细胞活性、致免疫性和毒 性等方面已有研宄。然而，在细胞摄取及细胞命运过程中没有相关报道。通过杯[4]芳烃 荧光衍生物探针可方便地用于研宄摄取和定位细胞器，为研宄和开发杯[4]芳烃药物和药 物传输系统提供有用的信息。
[0006] 目前报道的杯芳烃荧光探针文献不超过百篇，能应用于细胞中分子/离子荧光成 像为数甚少。Anja Mueller等在2011年报道了利用一种阳离子荧光标记的杯[4]芳烃，用 于细胞中溶酶体成像；Rakesh K. Pathak等在2012年报道了一种含亚氨基的三唑基-杯 [4]芳烃结构的Zn2+荧光探针，利用探针-Zn 2+配合物实现对活性HeLa细胞中组氨酸和半 胱氨酸的荧光成像。同年他们还报道了利用该杯芳烃-Cd 2+配合物用于细胞中半胱氨酸的 焚光成像，但都是基于焚光猝灭成像；Rakesh Kumar Pathak等于2013年报道了的双喹啉 修饰的硫杂杯[4]芳烃荧光探针，应用