基于拉曼光谱的灵芝孢子油氧化酸败的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种灵芝孢子油氧化酸败的检测方法，具体涉及一种基于拉曼光谱的 快速检测灵芝孢子油氧化酸败程度的方法。 (二）
【背景技术】
[0002] 灵芝又称灵芝草，是多孔菌科植物赤芝或紫芝的全株，自古以来就被推崇为中药 上品，在《神农本草经》等中医药典籍就早有记载。灵芝孢子是灵芝的有性生殖细胞，一般呈 淡褐色至黄褐色，卵形，大小一般在（长X宽）（8. 5~11. 2) y mX (5. 2~6. 9) y m之间， 内含灵芝孢子油。灵芝孢子油集中了灵芝有效成分的精华，富含三萜类灵芝酸、灵芝多糖、 核苷、氨基酸、饱和与不饱和脂肪酸、有机锗以及其它微量元素等多种活性成分。众多研宄 已经表明，灵芝孢子油具有增强细胞免疫、增强NK细胞活性、降血脂、免疫调节等功能，能 直接抑杀肿瘤干细胞，抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞的凋亡，抗氧化和减轻膀胱堵塞， 以及抗艾滋病毒活性的功能。同时由于其不饱和脂肪酸含量很高，更具有改善心脑血管疾 病、抗动脉硬化、降血脂、降胆固醇的作用。
[0003] 由于灵芝孢子油功效显著，价格昂贵，因此市场上相关产品质量参差不齐，严重影 响消费者利益。灵芝孢子油富含不饱和双键，孢子油在储存、运输过程中，尤其在高温、高湿 的条件下极易氧化，主要发生由活性氧自由基攻击双键引起降解，产生多种醛、酮、醇、酸及 羟酸等有害氧化物、过氧化物，生成强烈的刺激性气味（氧化酸败）会破坏机体正常的生理 生化功能（如引起机体氧化应激反应，降低机体免疫功能、导致小肠、肝脏等器官肥大等）， 严重损害身体健康。
[0004] 目前，业内通常采用食用油的质量监控指标即过氧化值、酸值作为孢子油的主要 质量监控指标。而国内测定灵芝孢子油酸值、过氧化值的方法主要是滴定法，包括标准酸碱 滴定和氧化还原滴定，但滴定法多少存在以下缺陷：如操作繁杂，需专业人员在实验室进行 分析；耗时长，检测需数小时完成；不便携，难以户外现场检测；灵敏度不够高，消耗样品量 多（5~10g)，检测成本高。
[0005] 近年来随着现代化检测技术的发展，一些新技术不断被用到食品检测领域，如 HPLC、NMR、色质联用（GC-MS)、荧光光谱等。这些方法与传统方法相比都有一定的优势，但 在进行检测时，尤其是对灵芝孢子油这类较为昂贵的物质，皆有一定的局限性。如高效液相 色谱法（HPLC)，与传统方法比，有高速、样品不被破坏、易回收等优点，但其不易携带，难以 户外检测，与拉曼光谱相比，其灵敏度仍不如拉曼光谱，耗时也较长。色谱法（GC)检测时， 虽然其分辨效率高，定量分析简便，但其定性能力较差。而质谱法（MS)，与色谱法相对应，它 的定性能力较强，灵敏度高，但在检测过程中要求进样要纯，进行定量分析较为复杂。 (三）
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于利用拉曼光谱技术建立一种灵芝孢子油氧化酸败的动态监测方 法以及灵芝孢子油酸值、过氧化值的快速检测新技术，并利用该方法测定灵芝孢子油氧化 酸败的动力学参数，筛选出高效的灵芝孢子油抗氧化剂。
[0007] 为达到发明目的，本发明采用的技术方案是：
[0008] 一种基于拉曼光谱的灵芝孢子油氧化酸败的检测方法，所述灵芝孢子油的氧化酸 败程度以灵芝孢子油的酸值（AV)、过氧化值（POV)作为评价指标，灵芝孢子油的氧化酸败 程度随着酸值、过氧化值的升高而增加，所述的检测方法包括如下步骤：
[0009] (1)建立灵芝孢子油酸值、过氧化值评价标准图
[0010] 取灵芝孢子油，置于70°c恒温器中避光敞口保存，每隔24~36h搅拌一次混匀，在 5天内，以每隔24小时的时间梯度取样，每次取样后对样品进行检测，用标准滴定法分别测 定灵芝孢子油样品的酸值、过氧化值，用拉曼光谱仪测得灵芝孢子油样品的拉曼光谱图，获 得一系列样品的酸值、过氧化值、拉曼光谱图；
[0011] 所述灵芝孢子油的拉曼光谱的检测方法为：取20~200 y L灵芝孢子油样品，置于 毛细管或者样品管中，放入拉曼光谱仪样品池中，激光强度选择高档，激光照射时间设定为 10s，自动进行环境杂散光校准和基线校正，样品测定5次次进行平均，得到灵芝孢子油样 品的拉曼光谱图，计算拉曼光谱图中1655CHT 1的拉曼峰积分强度（拉曼峰积分强度是用分 析软件Grams里的峰面积的积分功能计算的，软件自动计算，然后拷贝或输出数据即可）；
[0012] 以拉曼光谱图中1655cm 1的拉曼峰积分强度为纵坐标、样品的酸值为横坐标作 图，获得灵芝孢子油的酸值评价标准图；以拉曼光谱图中1655CHT 1的拉曼峰积分强度为纵 坐标、样品的过氧化值为横坐标作图，获得灵芝孢子油的过氧化值评价标准图；
[0013] (2)供试样品的检测
[0014] 取20~200 y L灵芝孢子油供试样品，置于毛细管或者样品管中，放入拉曼光谱仪 样品池中，激光强度选择高档，激光照射时间设定为l〇s，自动进行环境杂散光校准和基线 校正，样品测定5次进行平均，得到灵芝孢子油供试样品的拉曼光谱图；计算拉曼光谱图中 1655CHT 1的拉曼峰积分强度，将计算得到的1655CHT1拉曼峰积分强度结果分别与步骤（1) 得到的酸值评价标准图、过氧化值评价标准图进行对照，获得供试样品的酸值和过氧化值， 进而得出灵芝孢子油供试样品的氧化酸败程度评价结果。
[0015] 本发明所述的基于拉曼光谱的灵芝孢子油氧化酸败的检测方法，步骤（1)中，所 述灵芝孢子油样品的酸值、过氧化值的标准滴定法记载于：国家药典委员会.中华人民共 和国药典（一部）.北京：中国医药科技出版社，2010.附录54-55.和附录56-57.
[0016] 具体为：
[0017] (a)灵芝孢子油样品酸值的检测
[0018] 用氢氧化钠标准滴定法测灵芝孢子油酸值：在250mL锥形瓶中事先加入乙醇、乙 醚各25. OmL混合，精确称取灵芝孢子油样品0. 500g加入锥形瓶中，振荡使其完全溶解。用 氢氧化钠滴定液（〇. lmol/L)滴定至粉红色并连续30s不褪色，读取消耗氢氧化钠滴定液体 积（mL)。
[0019] 酸值的计算公式：
[0020] AV = (AX5. 61)/ff (1)
[0021] 式中：AV为酸值;A为消耗氢氧化钠滴定液（0. lmol/L)的体积（mL) ;W为试样取 样量（g) ;5. 61为每毫升氢氧化钠滴定液（0. lmol/L)相当于氢氧化钠的毫克数，可根据标 定后氢氧化钠滴定液的准确浓度进行校正。
[0022] 乙醚和乙醇的混合物配制：取乙醇、乙醚各25. OmL于250mL锥形瓶混匀，临用前先 加0. 5 %的酚酞指示液lmL，摇匀，滴加氢氧化钠滴定液适量，调至微显粉红色。
[0023] 0. lmol/L氢氧化钠滴定液的配制：先配制氢氧化钠饱和溶液，称取过量氢氧化 钠固体溶于蒸馏水中，其中氢氧化钠固体溶解度为lllg(20°C )，移液管准确移取上清液 1. 4mL于250mL容量瓶中用新煮沸冷却的无二氧化碳蒸馏水定容。
[0024] 氢氧化钠滴定液的标定：精确称取在105°C干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约 0. 600g，加新沸过的冷水50.0 mL振摇，使其尽量溶解；加0. 5 %酚酞指示液2滴，用本液滴 定至溶液显粉红色。每lmL的氢氧化钠滴定液（0. lmol/L)相当于20. 42mg的邻苯二甲酸 氢钾。标定结果的计算公式为：
[0026] 式中：W为邻苯二甲酸氢钾的称样量（g) ;V为标定时消耗氢氧化钠滴定液的体积 (mL) 〇
[0027] 0.5%酚酞溶液的配制：称取0.5(^酚酞，溶解于10〇11〇5%的乙醇中，无需加水。 试验重复三次并计算其平均值。
[0028] (b)灵芝孢子油样品过氧化值的检测
[0029] 在250mL干燥碘瓶中加入1.500g的灵芝孢子油，之后混入1:1调制的氯仿-冰醋 酸的混合液30.OmL，通过不断震荡摇匀样品。待充分摇匀后加入约1.OmL新配制的碘化钾 饱和溶液，加入后轻轻摇动半分钟时间，待摇匀后放置于暗处静置5分钟。随后向碘瓶内加 水80.OmL，使之混匀，然后用标准硫代硫酸钠滴定液（0. lmol/L)滴定，先滴定至溶液呈现 浅黄色，然后加入淀粉溶液，作为反应指示剂，滴定至蓝色消失，此时达到的即为滴定终点。 以硫代硫酸钠溶液的体积消耗数，计算油脂的过氧化值（P0V)。计算公式：
[0030] P0V = (V1-V2) X0. 001296M_1X 100 (3)
[0031] 式中：VI为样品消耗的标准硫代硫酸钠体积（mL) ;V2为空白试验消耗的标准硫代 硫酸钠体积（mL) ;M为样品质量（g)。
[0032] 试验重复三次并计算其平均值。
[0033]