一种基于尿中睾酮检测新型睾酮兴奋剂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于尿中睾酮检测新型睾酮兴奋剂的方法，属于医学检测领域。
【背景技术】
[0002] 反兴奋剂技术的进步保障了竞技体育的健康持续发展，兴奋剂检测的实施必须严 格遵循世界反兴奋剂机构（WorldAnti-DopingAgency,WADA)公布的禁用物质检测规则。
[0003] 睾酮是经常被使用的一种内源性类固醇兴奋剂。人体自身所分泌的睾酮与药用睾 酮化学结构相同，但研究表明，药用睾酮与人体分泌的睾酮的碳元素同位素比（13c/12c，单 位为％ )不同。药用睾酮的13C/12C值低于-27%。，而人体自身分泌的睾酮，13C/12C值范围 为-16. 7%。至-25. 8%。，当人体服用药用睾酮后，13C/12C值会降低。因此，WADA规定使用同 位素比质谱（Isotoperatiomassspectrometry,IRMS)测定碳元素同位素比值（13C/12C， 单位为％ )，以区分人体分泌的睾酮与体外摄入的药用睾酮，气相色谱/燃烧炉/同位素比 质谱（gas-chromatography/combustion/isotoperatiomassspectrometry,GC/C/IRMS) 可测定同位素比，以S值（％。）表示。
[0004] 现有研究表明，在碳4位上13C标记的睾酮有商品出售（如Testosterone-3， 4_13C2)，它与药用睾酮混合后可以组成一种新型睾酮兴奋剂，当使用此种新型睾酮兴奋剂 后， 13C/12C值值）落入人体分泌的睾酮的13C/12C值值）范围内。因此，已有的检测 方法无法检测这种新型睾酮兴奋剂了。
[0005] 目前，有基于雄酮的方法用于此种新型睾酮兴奋剂的检测。但是当人体摄入多种 药物，会导致尿样成分的多样性及复杂性。此时检测尿样中雄酮时，因干扰因素的存在，会 影响检测结果。因此，对此种新型睾酮兴奋剂应该开发新的检测方法，以适应不同的检测情 况。
[0006] 睾酮（Testosterone)，别名：睾留酮，睾丸留酮，睾丸激素；分子式：C19H2S02。结构 如下：
[0007]
[0008] 睾酮为常用药物制剂。在人体内代谢后，与葡萄糖醛酸结合，生成睾酮葡萄糖醛酸 甙，进入尿液被排出体外。
【发明内容】
[0009] 本发明所要解决的技术问题是提供一种基于尿中睾酮检测新型睾酮兴奋剂的方 法，用于新型睾酮兴奋剂的检测，本方法检测灵敏，准确性高。
[0010] 在13c标记的睾酮中，4位碳是被标记的主要位置之一。睾酮在人体代谢后，一部 分药物原型与葡萄糖醛酸结合，从尿中排出。本申请发明人经过研究发现，将人尿中睾酮 提取出来，并经化学反应，将其分子中C-4位标记的13C消除，生成新化合物4-氧杂环-雄 甾-5稀-3,17-二酮（4-〇xa-androst-5-ene_3, 17-dione)，消除4位碳前后的两个化合物 的13C/12C值值）产生较大差异，利用此特性可以检测新型睾酮兴奋剂。
[0011] 本申请发明人经研究发现，将尿样中睾酮反应生成 4-〇xa-androst-5-ene-3, 17-dione的方法中，操作条件十分重要，为了得到高产率的新化 合物4-〇xa-androst-5-ene-3, 17-dione，需严格遵守所用化学试剂、化学试剂用量和操作 步骤。
[0012] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种基于尿中睾酮检测新型睾酮兴奋 剂的方法，包括：
[0013] 取尿样20mL，加入5mLpH= 7. 0的磷酸盐缓冲液和200yL0 -葡萄糖醛酸甙酶溶 液，混匀，在55°C恒温水浴中酶解3小时，取出，加入20mL叔丁基甲醚振荡萃取，离心，吸取 上层有机溶液，在60°C加热的情况下用氮气吹干，再用50yL100%乙腈溶剂溶解，转入样 品瓶中，封盖，以HPLC纯化，收集11-12分钟含有睾酮的流出液0. 6ml，取50yL的流出液， 在60°C加热的情况下用氮气吹干，采用同位素比质谱仪分析其碳元素同位素比，得睾酮的 S灌，余下的流出液在60°C加热的情况下用氮气吹干，得睾酮；
[0014] 取上述制备的睾酮，加入10yL叔丁醇，再加入5iiL无水碳酸钠水溶液，震荡使其 混匀，加入20yL氧化剂，在95°C保持3小时，再加入150yL水，用稀盐酸调节pH至1. 5， 用150yL叔丁基甲醚提取两次，合并提取液，提取液用氮气吹干后，加入7yL醋酐和7yL 乙酰氯，在45°C保持2. 5小时，得反应液，反应液用氮气吹干，再加入超纯水分散残渣，加入 150yL质量分数5%的碳酸氢钠水溶液调节pH至8,用150yLCH2C12提取，有机层用水洗 至pH= 7，在60 °C加热的情况下用氮气吹干，得到4-〇xa-androst-5-ene-3, 17-dione，采用 同位素比质谱仪分析其碳元素同位素比，得4-〇xa-androst-5-ene-3, 17-dione的5 2值；
[0015]考察睾酮的 5 丨值与 4-〇xa-androst-5-ene_3, 17-dione的 5 2值，如 8 广 82的 差值大于2. 8%。，则表明尿样为使用新型睾酮兴奋剂的尿样。
[0016] 将差值界限设为2. 8%。，依据WADA技术文件（WADATechnical Document,Availablefrom:https://www.wada-ama.org/en/resources/science-medic ine/td2014-irms)，检测误差为±2. 8%。，取其绝对值为2. 8%〇。
[0017] 在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0018] 进一步，所述HPLC纯化的步骤为：进样量为50yL，色谱柱为ZORBAXSB-C18,规 格为4. 6mmX250mmX5ym，流动相为乙腈-水系统，洗脱起始流动相体积比例为：30 %乙 腈-70%水，等梯度洗脱，于20分钟内完成至流动相为100%乙腈，流速lmL/min。
[0019] 进一步，所述无水碳酸钠水溶液的组成比例关系为：2. 25g无水碳酸钠加入10ml 水。
[0020] 进一步，所述氧化剂由浓度30mg/ml的高碘酸钠水溶液与浓度0. 5mg/ml的高猛酸 钾水溶液等体积比例组成。
[0021] 本发明的有益效果是：
[0022] 本发明提供一种基于尿中睾酮检测新型睾酮兴奋剂的方法，适用于掺有13C标记 的新型睾酮兴奋剂，主要是基于尿样中睾酮进行检测，本方法检测灵敏，准确性高。
【附图说明】
[0023] 图1为实施例1中4-〇xa-androst-5-ene_3, 17-dione对照品的GC总离子流图；
[0024] 图2为实施例1中4-〇xa-androst-5-ene_3, 17-dione对照品的MS质谱图谱；
[0025] 图3为实施例1中由尿样中睾酮制备的4-〇xa-androst-5-ene_3, 17-dione的GC 总尚子流图。
[0026] 图4为实施例1中由尿样中睾酮制备的4-〇xa-androst-5-ene_3, 17-dione的MS 质谱图谱。
【具体实施方式】
[0027] 以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限 定本发明的范围。
[0028] 实施例1
[0029] -、仪器设备
[0030] 十万分之一电子天平：Satorious公司，瑞士；
[0031] 离心机：LD5-2A，北京医用离心机厂；
[0032]超纯水制备仪：Milli-Q，MILLIP0RE公司；
[0033]高效液相色谱仪（HPLC):Waters2796 ;自动收集器：WatersFractionCollector III，Waters公司；
[0034]气相色谱 / 质谱联用仪（GC/MS) :HP6890/5973,AgilentTechnologies;
[0035]气相色谱/燃烧炉/ 同位素比质谱仪（GC/C/IRMS):DELTAV，ThermoScientific。
[0036]二、试剂
[0037] 磷酸盐缓冲液：在0. 2mol/l磷酸二氢钾水溶液中，逐渐加入0. 2mol/l磷酸氢二钾 水溶液，用pH计检测pH值，直至pH= 7. 0。
[0038] 0 _葡萄糖醛酸戒酶（购自Sigma-Aldrich公司）溶液：取0 -葡萄糖醛酸戒酶 0-GlucuronidasefromE.coliIX-A型（Sigma)适量，溶解于磷酸盐缓冲液中，配制成 50, 000unit/mL的溶液，置-4°C冰箱保存，备用。
[0039] 三、仪器操作条件
[0040] GC/MS仪器操作条件
[0041] 色谱柱及升温程序：HP-5毛细管色谱柱，30mX0. 2mmi.d.X0. 33ym，起始温度 为180°C，保持1分钟，以每分钟6. 5°C的速率升温至260°C，再以每分钟3°C的速率升温至 290 °C，保持1分钟。
[0042]接 口温度：300°C;
[0043] 采用恒流模式，柱流速：lmL/min;
[0044] 不分流；
[0045]进样 2yL;
[0046] 质谱离子源为EI源，70eV;
[0047] 采集模式：SCAN方式，采集质量范围：5-500amu。
[0048] 四、方法
[0049] 取尿样20mL，加入5mLpH= 7. 0的磷酸盐缓冲液和200yL的-葡萄糖醛 酸甙酶溶液，混匀，在55 °C恒温水浴中酶解3小时，取出，加入20mL叔丁基甲醚振荡 萃取，离心，吸取上层有机溶液，在60°C加热的情况下用氮气吹干，再用50iiL100% 乙腈溶剂溶解残渣，转入样品瓶中，封盖。以HPLC纯化，进样50yL，色谱柱Z0RBAX SB-C18 (4. 6mmX250mmX5ym)，流动相为乙腈-水系统，20分钟内完成此系统体积比例变 化，由30% : 70%到100% :0,等梯度洗脱，流速1.OmL/min。收集11-12分钟含有睾酮的流 出液0. 6ml，取50yL的流出液，在60°C加热的情况下用氮气吹干，采用同位素比质谱仪分 析其碳元素同位素比，得睾酮的81值，余下的流出液在60°C加热的情况下用氮气吹干，得 睾酮；
[0050] 取上述制备的睾酮，加入10 yL叔丁醇，再加入5 yL无水碳酸钠水溶液（无 水碳酸钠水溶液的组成比例关系为：2. 25g无水碳酸钠加入10ml水），震荡使其均匀， 加入20 y L氧化剂，所述氧化剂由浓度30mg/ml的高碘酸钠水溶液与浓度0. 5mg/ml的 高锰酸钾水溶液等体积比例组成，在95 °C保持3小时，再加入150 iiL水，用稀盐酸调 节pH至1.5,用150 yL叔丁基甲醚提取两次，合并提取液，提取液用氮气吹干后，加 入7 y L醋酐和7 y L乙酰氯，在45 °C保持2. 5小时，得反应液，反应液用氮气吹干，再 加入超纯水分散残渣，加入15 0 y L质量分数5%的碳酸氢钠水溶液调节p H=8，用 150yL CH2C12提取，有机层用水洗至pH=7,在60°C加热的情况下用氮