一种禽蛋中金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦林、吗啉胍残留的多联检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于禽类产品检测技术领域，涉及一种无污染、高效的多联测定禽蛋中金 刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦林和吗啉胍残留的方法。
【背景技术】
[0002] 自上世纪60年代以来，人类已经开发上市二十几种抗病毒药物，其中金刚烷胺、 金刚乙胺、利巴韦林、吗啉胍等四种药物对流感病毒都有一定抑制作用，将它们移植兽用， 虽然对禽类流感等病毒有一定的抑制作用，但缺乏科学规范、安全有效性的实验数据。若长 期大量使用这些药物会导致动物中毒、免疫抑制、药物残留等问题，同时还可使病毒产生变 异，最终给人类身体健康造成了巨大的危害。农业部发布的第560号公告明确要求金刚烷 胺、金刚乙胺、利巴韦林、吗啉胍等被列入首批《兽药地方标准废止目录》。目前，国内和行业 中很少有禽蛋中金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦林和吗啉胍留量的多联检测方法。我国现行的 地方标准DB32/T1163-2007《禽肝中金刚烷胺残留的测定液相色谱-串连质谱法》、DB32/ T1165-2007《禽肝中利巴韦林及其代谢物残留总量的测定液相色谱-串连质谱法》、行业标 准SN/T2654-2010《进出口动物源性食品中吗啉胍残留检测方法液相色谱-串连质谱法》， 以上方法仅对单一药物进行检测分析，不能满足目前对禽蛋类产品的检测需求。
[0003] 关于金刚烷胺类化合物、利巴韦林和吗啉胍的分析方法通常采用气相色谱法 (GC)、气相色谱仪串联质谱法（GC-MS)、液相色谱法（LC)及液相色谱串联质谱法（LC-MS/ MS)。GC和GC-MS均需要复杂的衍生处理过程，再进行检测，操作过程较为复杂，而具有高选 择性、高灵敏度特点的LC-MS/MS在抗病毒药物化合物的检测中具有一定的优势，但仍需要 较好的前处理方式以降低LC-MS/MS的基质效应，尤其是对于复杂的动物组织样品，具有一 定的局限性。
[0004] 中国专利（CN201210228633. 9)公开了一种LC-MS/MS法检测人尿样中地西泮及其 体内代谢物的分析方法，只能单一检测一种药物及代谢物，前处理方法也与动物组织样品 的处理大不相同，因此，一种能够降低LC-MS/MS的基质效应的样品前处理方法及有效将目 标化合物分离并进行定性和定量测定的方法亟待研发。
【发明内容】
[0005] 为解决上述技术问题，本发明首先采用物理方法，即低温反复冻融去大分子蛋白、 超声波超声去脂肪、阳离子交换固相萃取净化等方式进行前处理，避免引入外源污染物，提 高准确性；其次采用配有ESI源的液相色谱-串联质谱仪进行多联测定，极大的提高金刚 烷胺、金刚乙胺、利巴韦林和吗啉胍的灵敏度，有效将目标化合物分离并进行定性和定量测 定。本发明的方法具有较高的特异性，能无污染、准确同时测定出金刚烷胺、金刚乙胺、利巴 韦林和吗啉胍残留量，灵敏度高，为保证禽蛋质量安全提供技术支撑。
[0006] 本发明技术方案为提供一种禽蛋中金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦林和吗啉胍残留 的多联检测方法，样品经过低温反复冻融后，加入甲酸-甲醇溶液，混合，离心，取上清液备 用，加入水饱和正己烷，混合，超声，离心去除上层正己烷絮状物，下层为提取液，经阳离子 交换固相萃取柱净化，再用配有ESI源的液相色谱-串联质谱仪测定，对禽蛋中四种抗病毒 药物残留进行准确的定性和定量分析。具体通过以下步骤实现：
[0007] (1)、前处理：
[0008] 提取：样品经去壳、将蛋清和蛋黄打碎、均质匀浆后再经低温反复冻融，即低温 环境冷冻后，置于水浴中解冻，反复进行若干次，用甲酸-甲醇溶液提取，离心，取上清液， 加入水饱和的正己烷，经超声波超声提取处理，去除上层正己烷絮状物，下层为提取液，备 用；
[0009] 净化：用阳离子交换固相萃取柱对备用的提取液进行洗脱净化，经甲酸-甲醇水 溶液定容，过0. 22ym滤膜后为待测液；
[0010] ⑵、绘制标准曲线：取标准工作液，用0. 1 %甲酸水溶液+甲醇（20 : 80,v/v) 进行不同倍数稀释，使金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦林、吗啉胍最终溶液浓度为〇. 01ng/mL、 0? 5ng/mL、L0ng/mL、2. 0ng/mL、5.Ong/mL、10. 0ng/mL、25. 0ng/mL、50.Ong/mL、100.Ong/mL、 200.Ong/mL，进LC-MS/MS分析，绘制标准曲线；
[0011] (3)、LC-MS/MS检测分析：将步骤（1)的待测液进行液相色谱-串连质谱法定性和 定量分析。
[0012] 进一步的，所述低温反复冻融的低温冷冻温度为-30°c~-20°c，次数为2~3次， 每次2~4小时。优选为在-26°C低温环境放置2h，取出后放于50°C水浴锅中解冻0. 5h， 反复冻融2次。
[0013] 进一步的，所述超声波超声提取的条件为超声强度400~700W、超声时间10~ 20min;优选为超声强度600W、超声时间15min。
[0014] 进一步的，阳离子交换固相萃取柱为CleanertPCX柱，填料的重量和柱体容积为 30mg/lml、60mg/lml、60mg/3ml，优选为 60mg/3ml。
[0015] 进一步的，所述步骤（2)中仪器检测分析条件为：
[0016] 色谱条件为：①色谱柱：AgilentZorbaxEclipsePlusC18反相色谱 柱（2. 1X50mm，1. 8ym);②柱温：40°C;流速：0? 3mL/min;进样量：10yL;③流动相： A-5mmol/L乙酸铵水溶液，B-乙腈溶液，梯度洗脱程序见表1 :
[0017] 表1流动相梯度洗脱条件
[0018]
[0019] 质谱条件为：①离子化模式：电喷雾电离源，简称ESI;②扫描方式：正离子扫描； ③雾化气压力：40psi;④干燥气流速：9.OL/min;⑤干燥气温度：350°C;⑥毛细管电压： 4.Okv;⑦扫描模式：多重反应监测（MRM);⑧碰撞气压力：氩气，1. 4mTorr。多重反应监测母 尚子、子尚子和碰撞能量见表2 :
[0020] 表2多重反应监测母离子、子离子和碰撞能量
[0021]
[0022] 进一步的，所述样品为生鲜鸡蛋。
[0023] 本发明的有益效果是：
[0024] (1)使用低温反复冻融清除蛋白质、超声波超声提取脂肪、阳离子交换固相萃取净 化方法，可以消除内外源物质干扰。本发明具有良好的回收率和灵敏度，不受内外源性杂质 的干扰，符合食品样品分析要求，能快速灵敏地检测出禽蛋中金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦 林和吗啉胍残留量，适用于禽蛋中兽药残留质量安全控制。
[0025] (2)采用配有ESI源的液相色谱-串联质谱法，研究出金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦 林和吗啉胍四种药物前处理、液相色谱分离和质谱仪定性定量条件，具有分析时间短、精确 度高、多联检测等优点，对科学研究和评价禽蛋中兽药残留质量控制具有重要的意义。
【附图说明】
[0026] 图1金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦林、吗啉胍标准品MRM扫描总离子流色谱图；
[0027] 图2金刚烷胺MRM扫描质谱提取图；
[0028] 图3金刚乙胺MRM扫描质谱提取图；
[0029] 图4利巴韦林MRM扫描质谱提取图；
[0030] 图5吗啉胍MRM扫描质谱提取图；
[0031] 图6金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦林、吗啉胍标准曲线图；
[0032] 图7金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦林、吗啉胍标准曲线图；
[0033] 图8金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦林、吗啉胍标准曲线图；
[0034] 图9金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦林、吗啉胍标准曲线图；
[0035] 图10空白样品中金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦林、吗啉胍MRM扫描总离子流色谱 图。
【具体实施方式】
[0036]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例 中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是 本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员 在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0037] 本方法选择禽蛋中常见的生鲜鸡蛋为实施例。
[0038] 实施例1 :
[0039] (1)本实例中采用的主要仪器设备和材料：
[0040] 超高效液相色谱串联质谱仪（Agilent，型号1260-6460);超高速离心机（日立，型 号CR22GIII)〇
[0041] 水相微孔滤膜（艾杰尔科技，0.22ym);阳离子交换固相萃取柱（艾杰尔科技， CleanertPCX，60mg/3ml)〇
[0042] (2)样品的处理步骤：
[0043] 提取：取3个鸡蛋样品，经去壳