乙酰金刚烷胺的单克隆抗体的制作方法
【专利摘要】一种制备抗体的方法，其包含用乙酰金刚烷胺的胺衍生物免疫哺乳动物，用乙酰金刚烷胺免疫该哺乳动物，和从该哺乳动物制备抗体。该抗体识别乙酰金刚烷胺但不识别金刚烷胺。
【专利说明】乙酰金刚院胺的单克隆抗体
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求美国临时专利申请序列号61/484，521的优先权，所述临时专利申请2012年5月10日提交并且全部内容以引用方式并入本文。
【背景技术】【技术领域】
[0003]本发明涉及用于量化定量精胺/精脒N1-乙酰转移酶(SSAT)酶活性的方法和组合物。
_4] 相关技术说明
[0005]精脒/精胺N1-乙酰转移酶(SSAT)普遍分布于哺乳动物组织中并且在细胞的多胺的分解代谢和消除中起作用。SSAT为诱导酶，其催化乙酰基从乙酰辅酶A到多胺的氨丙基部分的转移。SSAT这一行为有利于多胺降解、排泄和循环和/或胞内循环。以此方式，SSAT参与哺乳动物细胞中多胺体内平衡的维持。然而，在正常或非诱导的哺乳动物组织中，SSAT以极低水平存在。
[0006]不同药物、生长因子、多胺、多胺类似物、有毒物质、激素和生理刺激可以诱导SSAT表达。虽然所有前述化合物均可能诱导SSAT表达，但对于每个单独化合物，诱导发生在不同的时间。SSAT表达的调节在转录、mRNA稳定性、mRNA翻译和蛋白稳定性的水平发生。在体外实验可能成功进行之前，SSAT的诱导或过量表达通常需要细胞中有足够的SSAT酶或100，OOOxg 上清液。
[0007]虽然当前文献教导了 SSAT为乙酰化酶，其特异性底物包括精胺和精脒或其类似物，但SSAT活性、SSAT酶动力学和用于SSAT的非精胺/精脒底物的测定方法尚未被理解。目前存在量化SSAT活性的方法。然而，这些技术依赖于高技能人员和复杂的实验方法。更具体地说，测定方法中，需要通过检测非精胺的乙酰化形式来量化SSAT活性。包括金刚胺在内的SSAT的精脒底物可用于检测各种病理状态。
[0008]传统方法如单独的或与质谱分析联用的气液色谱法(GLC)、高压液相色谱法(HPLC)用于测定乙酰化代谢物如乙酰金刚烷胺。检测灵敏性需要十亿分之几的目标分析物，这成为一个挑战。GLC和HPLC已经表明对于体外测定是有效的，但可能不适用于体内测定。引入氘化分析物作为HPLC-MS-MS方法的内标来测定乙酰金刚烷胺是成功的。
[0009]这些传统方法需要致使高操作成本和资本成本的劳动密集型分析服务。所有这些增加了医疗保健经济的低效率。另外，生物样品必须经物流处理并且运送至用于测定的中央实验室。这些操作可能致使样品质量改变并且致使结果的错误解释。
[0010]因此医疗点的测试方法需要最小化样品不稳定性并且降低医疗保健成本。在门诊办公室处的体外测 试诊断的形式还将允许迅速医疗决策。
【发明内容】
[0011] 本发明的一个目的为提供一种抗体、或其功能等同物或其功能部分，其识别乙酰金刚烷胺但不识别金刚烷胺。
[0012]因此相应地提供了一种产生抗体的方法，包括用乙酰金刚烷胺的胺衍生物免疫哺乳动物，用乙酰金刚烷胺免疫上述哺乳动物，和由上述哺乳动物制备抗体。该方法可能包括用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺将乙酰金刚烷胺的胺衍生物结合到卵白蛋白载体上以及在弗氏佐剂中乳化乙酰金刚烷胺-卵白蛋白结合物。该方法还可包括用偶合到所述乙酰金刚烷胺的抗生物素蛋白免疫上述哺乳动物。该动物可能由乙酰金刚烷胺的胺衍生物进行增强。抗体可以通过以下方法制备:获得来自哺乳动物外周血单核细胞的样品，在B淋巴细胞被多克隆活化的条件下培养该外周血单核细胞，和活化该B淋巴细胞以增殖和分化为抗体分泌细胞。所制备的抗体可能是单克隆抗体。
[0013]该单克隆抗体对由抗体-产生细胞产生的乙酰金刚烷胺可能是特异性的，所述抗体-产生细胞来自用结合到载体蛋白的乙酰金刚烷胺以及佐剂免疫的哺乳动物。
[0014]该单克隆抗体对乙酰金刚烷胺可能是特异性的，该乙酰金刚烷胺通过用在完全弗氏佐剂中乳化的10-500 μ g乙酰金刚烷胺-卵白蛋白结合物肌内免疫哺乳动物来制备。
[0015]该单克隆抗体对乙酰金刚烷胺可能是特异性的，该乙酰金刚烷胺通过用在完全佐剂中乳化的10-500 μ g乙酰金刚烷胺-卵白蛋白结合物肌内免疫哺乳动物来制备。
[0016]该单克隆抗体对乙酰金刚烷胺可能是特异性的，该乙酰金刚烷胺通过用在完全弗氏佐剂中乳化的100-400 μ g乙酰金刚烷胺-卵白蛋白结合物肌内免疫哺乳动物来制备。
[0017]该单克隆抗体对乙酰金刚烷胺可能是特异性的，该乙酰金刚烷胺通过用在完全弗氏佐剂中乳化的200-300 μ g乙酰金刚烷胺-卵白蛋白结合物肌内免疫哺乳动物来制备。
[0018]该单克隆抗体对乙酰金刚烷胺可能是特异性的，该乙酰金刚烷胺通过用与作为佐剂的明矾一起给药的10-200 μ g乙酰金刚烷胺-卵白蛋白结合物每1-6周对哺乳动物进行2-15次肌内免疫增强来制备。
[0019]该单克隆抗体对乙酰金刚烷胺可能是特异性的，该乙酰金刚烷胺通过用与作为佐剂的明矾一起给药的20-150 μ g乙酰金刚烷胺-卵白蛋白结合物每1-6周对哺乳动物进行2-15次肌内免疫增强来制备。
[0020]该单克隆抗体对乙酰金刚烷胺可能是特异性的，该乙酰金刚烷胺通过用与作为佐剂的明矾一起给药的30-100 μ g乙酰金刚烷胺-卵白蛋白结合物每1-6周对哺乳动物进行2-15次肌内免疫增强来制备。
[0021]该单克隆抗体对乙酰金刚烷胺可能是特异性的，该乙酰金刚烷胺通过用与作为佐剂的明矾一起给药的10-200 μ g乙酰金刚烷胺-卵白蛋白结合物每2-5周对哺乳动物进行2-15次肌内免疫增强来制备。
[0022]该单克隆抗体对乙酰金刚烷胺可能是特异性的，该乙酰金刚烷胺通过用与作为佐剂的明矾一起给药的20-150 μ g乙酰金刚烷胺-卵白蛋白结合物每2-5周对哺乳动物进行2-15次肌内免疫增强来制备。
[0023]该单克隆抗体对乙酰金刚烷胺可能是特异性的，该乙酰金刚烷胺通过用与作为佐剂的明矾一起给药的30-100 μ g乙酰金刚烷胺-卵白蛋白结合物每2-5对哺乳动物进行2-15次肌内免疫增强来制备。
[0024]该单克隆抗体对乙酰金刚烷胺可能是特异性的，其中该哺乳动物是在上一次增强的4周之后通过肌内免疫增强的，是用1-8 μ g抗生物素蛋白结合过量生物素化乙酰金刚烷胺和作为佐剂的明矾进行免疫。
[0025]该单克隆抗体对乙酰金刚烷胺可能是特异性的，其中该哺乳动物是在上一次增强的4周之后通过肌内免疫被增强的，是用2-6 μ g抗生物素蛋白结合过量生物素化乙酰金刚烷胺和作为佐剂的明矾进行免疫。
[0026]该单克隆抗体对乙酰金刚烷胺可能是特异性的，其中该哺乳动物是在上一次增强的4周之后通过肌内免疫被增强的，是用3-5 μ g抗生物素蛋白结合过量生物素化乙酰金刚烷胺和作为佐剂的明矾进行免疫。
[0027]该单克隆抗体可以包括其任何功能等同物抗体或其功能部分，所述抗体辨别乙酰金刚烷胺和金刚烷胺并因此检测酶活性。
[0028]该单克隆抗体可被用作乙酰金刚烷胺的量化工具。
[0029]该单克隆抗体可被用作检测精胺/精脒N1-乙酰转移酶活性的量化工具。
[0030]该单克隆抗体可被用作诊断工具来测定患者体内的精胺/精脒N1-乙酰转移酶。
【具体实施方式】
[0031]此处公开的是根据以下改进方案成功免疫动物的实施例，在该实施例中是兔子。这能够证明能产生可辨别乙酰金刚烷胺和金刚烷胺的独特的抗体。这表明能产生这样的单克隆抗体，其特异性结合到乙酰金刚烷胺，但这些相同抗体不结合到金刚烷胺。
[0032]乙酰金刚烷胺蛋白结合物的制备
[0033]根据制造商的操作说`明，用通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺结合乙酰金刚烷胺的胺衍生物的载体蛋白卵白蛋白的结合物免疫兔子。在该实施例中，制造商为 Thermo Fisher Scientific Inc., 3747North Meridian Road,罗克福德,伊利诺伊州，美国，61101。
[0034]乙酰金刚烷胺的胺衍生物采用下述合成方案合成。
[0035]金刚烷胺衍生物的合成
[0036]
【权利要求】
1.一种抗体，所述抗体识别乙酰金刚烷胺但不识别金刚烷胺。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
3.一种制备抗体的方法，包括: 用乙酰金刚烷胺的胺衍生物免疫哺乳动物； 用乙酰金刚烷胺免疫所述哺乳动物；和 从所述哺乳动物制备所述抗体。
4.如权利要求3所述的方法，还包括将所述乙酰金刚烷胺的胺衍生物结合到卵白蛋白载体上。
5.如权利要求4所述的方法，还包括用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺将所述乙酰金刚烷胺的胺衍生物结合到所述卵白蛋白载体上。
6.如权利要求4所述的方法，还包括在弗氏佐剂中乳化所述乙酰金刚烷胺的胺衍生物和所述卵白蛋白载体。
7.如权利要求3所述的方法，还包括用偶合到所述乙酰金刚烷胺的抗生物素蛋白免疫所述哺乳动物。
8.如权利要求3所述的方法，还包括用所述乙酰金刚烷胺的胺衍生物对所述哺乳动物进行增强。
9.如权利要求3所述的方法，还包括: 获得来自所述哺乳动物的外`周血单核细胞的样品； 在B淋巴细胞被多克隆活化的条件下培养所述外周血单核细胞；和 活化所述B淋巴细胞以增殖和分化为抗体分泌细胞。
10.如权利要求1或2所述的抗体的用途，所述抗体作为诊断工具来测定患者中的精胺/精脒N1-乙酰转移酶。
【文档编号】C12P21/00GK103608358SQ201280024582
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2012年5月10日 优先权日:2011年5月10日
【发明者】布莱恩·郑, 拉希德·巴克斯, 格雷戈里奥·阿韦尔萨, 布拉姆·拉姆贾汪, 丹尼尔·西塔尔 申请人:百奥马克科技有限公司