一种检测苯乙醇胺a的试纸条及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测苯乙醇胺A的试纸条及方法。
【背景技术】
[0002] 苯乙醇胺A(Phenylethylamine，PEA)化学名为2-[4_(4_硝基苯基）丁基-2羟基 氨基]-1甲氧基苯乙醇盐酸盐，其分子式为C 19H24N2O4。苯乙醇胺A俗称"克仑巴胺"，是2010 年发现的一种新型营养重分配剂，具有与克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇等相同的作用 和效果。从分子结构上看，苯乙醇胺A与克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇均属于β-兴奋 剂类药物。畜产品中β_兴奋剂类药物残留会对人体健康带来巨大危害，人食用含有苯乙 醇胺A的肉后，会出现恶心、头晕、四肢无力、手颤等中毒症状，甚至诱发高血压、心脏病等， 长期食用则有可能导致染色体畸变，诱发恶性肿瘤。农业部第1519号公告已明令禁止苯乙 醇胺A在饲料和动物饮水中使用。β -激动剂类药物进入动物体内后，主要是经尿液排泄， 因此监控动物是否喂苯乙醇胺A最有效的检测样本是尿液。
[0003] 目前关于苯乙醇胺A在动物尿液中检测方法的研究报道较少，检测主要为高效液 相色谱法、液相色谱-串联质谱法、气相色谱-串联质谱法等。我国2010年底颁布的检测 标准《饲料中苯乙醇胺A的测定》（农业部1486号公告-1-2010)采用了高效液相色谱-串 联质谱法；《动物尿液中苯乙醇胺A的测定》（农业部1879号公告-1-2012)采用了液相色 谱-串联质谱法。期刊文献中有关于苯乙醇胺A测定方法有：卢艳芬开发了超高效液相色 谱-串联质谱法测定猪肉和猪尿中的苯乙醇胺A的方法；董文婷等人开发了液相色谱-串 联质谱法测定猪尿中苯乙醇胺A ;徐素彬等人开发了高效液相色谱-串联质谱法对家畜尿 液中苯乙醇胺A残留检测的研究。专利文献中有关于苯乙醇胺A的测定方法有：申请号为 201210432887. 2的检测苯乙醇胺A的化学发光免疫检测试剂盒；申请号为201210146490. 7 的一种检测苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒。上述标准、文献所述的苯乙醇胺A的检测方法 主要是分析仪器方法、化学发光免疫检测法和酶联免疫检测法，其中分析仪器方法检测成 本高，需要专业技术人员操作，检测时间长，对于现场取尿检测工作的开展具有局限性。酶 联免疫检测法需要配套酶标仪，化学发光免疫检测法需要配备化学发光检测仪，不便于在 现场检测携带。因此开发出一种苯乙醇胺A的快速检测方法显得非常必要。本发明的检 测苯乙醇胺A的试纸条具准确度高、有操作简单、无需专业人员操作、无需配套其他检测设 备、方便携带检测时间短、检测成本低等特点，适用于现场大量样品的筛查。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种检测苯乙醇胺A的试纸条。
[0005] 本发明所提供的检测苯乙醇胺A的试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应 膜、吸水垫和底板，所述反应膜上有检测区和质控区，检测区包被有苯乙醇胺A半抗原-载 体蛋白偶联物，质控区包被有抗抗体，所述结合物释放垫喷涂有苯乙醇胺A特异性抗体-胶 体金标记物。苯乙醇胺A特异性抗体-胶体金标记物中的苯乙醇胺A特异性抗体是以苯乙 醇胺A半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。
[0006] 优选地，所述试纸条由样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次黏贴在底 板上组成。
[0007] 优选地，所述结合物释放垫1/3~1/2被覆盖于样品吸收垫下。所述的检测区靠 近样品吸收垫一端，质控区靠近吸水垫一端。
[0008] 优选地，所述苯乙醇胺A半抗原-载体蛋白偶联物由苯乙醇胺A半抗原与载体蛋 白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白 蛋白。
[0009] 优选地，所述苯乙醇胺A特异性抗体可为苯乙醇胺A单克隆抗体或苯乙醇胺A多 克隆抗体。
[0010] 优选地，苯乙醇胺A半抗原是通过苯乙醇胺A与溴代戊醛发生反应而得到的。
[0011] 优选地，所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为 无纺布或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃纤维或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所 述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
[0012] 本发明的另一个目的是提供了一种制备上述试剂盒的方法，其步骤包括：
[0013] (1)制备喷涂有苯乙醇胺A单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；
[0014] ⑵制备具有包被有苯乙醇胺A半抗原-载体蛋白偶联物的检测区和包被有羊抗 鼠抗抗体的质控区的反应膜；
[0015] (3)将（1)和（2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组 装成试纸条。
[0016] 具体地说，步骤包括：
[0017] (1)将苯乙醇胺A与溴代戊醛发生亲核取代反应，得到苯乙醇胺A半抗原；
[0018] (2)将苯乙醇胺A半抗原与载体蛋白偶联，得到苯乙醇胺A半抗原-载体蛋白偶联 物；
[0019] (3)用苯乙醇胺A半抗原-载体蛋白偶联免疫物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤 细胞通过融合、筛选得到苯乙醇胺A单克隆杂交瘤细胞株；
[0020] (4)提取小鼠 IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；
[0021] (5)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；
[0022] (6)将步骤（3)制备的苯乙醇胺A单克隆抗体加入步骤（5)制备的胶体金中，得到 苯乙醇胺A单克隆抗体-胶体金标记物；
[0023] (7)将苯乙醇胺A单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37°C烘Ih 后取出，置于干燥环境中保存备用；
[0024] (8)将苯乙醇胺A半抗原-载体蛋白偶联物包被再反应膜上构成检测区，将羊抗鼠 抗抗体包被在反应膜上构成质控区；
[0025] (9)将样品吸收垫用含0· 5%牛血清白蛋白（体积分数）、pH为7. 2、0. lmol/L磷 酸盐缓冲液浸泡2h，37°C下烘干2h ;
[0026] (10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸 收垫盖住结合物释放垫，最后切成3_宽的小条，加塑料盒，真空包装，4~30°C条件下可保 存12个月。
[0027] 本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测动物尿液中苯乙醇胺A残 留的方法，动物尿液可以为猪尿、牛尿和羊尿等反刍动物尿液，它包括步骤：
[0028] (1)用试纸条进行检测；
[0029] (2)分析检测结果。
[0030] 本发明的苯乙醇胺A残留检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及竞争抑 制免疫层析分析技术，将苯乙醇胺A单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样 品中的苯乙醇胺A在流动过程中，与结合物释放垫上的苯乙醇胺A单克隆抗体-胶体金标 记物结合，形成药物-抗体-胶体金标记物。样品中的药物与反应膜检测区上的苯乙醇胺A 半抗原-载体蛋白偶联竞争结合苯乙醇胺A单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测区红色 条带有无或颜色深浅来判断待测样品液中是否含有苯乙醇胺A残留。
[0031] 检测时，样品直接滴入试纸条孔内，当苯乙醇胺A在样品中的浓度低于试纸条检 测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的苯乙醇胺 A半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测区（T)和质控区（C)内各出现一条红色条带；如果 苯乙醇胺A在样品中的浓度等于或高于试纸条检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与苯 乙醇胺A全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与苯乙醇胺A半抗原-载体蛋白偶联 物结合而不出现红色条带。
[0032] 阴性：当质控区（C)显示出红色条带，检测区⑴同时也显示出红色条带，判为阴 性，表明样品中苯乙醇胺A的浓度低于试纸条检测限。
[0033] 阳性：当质控区（C)显示出红色条带，而检测区⑴不显色，判为阳性，表明样品中 苯乙醇胺A的浓度等于或高于试纸条检测限。
[0034] 无效：当质控区（C)不显示出红色条带，则无论检测区（T)显示出红色条带与否， 该试纸条均判为无效。
[0035] 本发明的试纸条有益效果：本发明的试纸