f质谱仪中进行分析。
[0017]实施例2:
将20mg僵蚕粉碎，得细粉，加入1000 μ L水，超声提取30分钟，12000r/min离心15分钟；将上清液缓慢加入50mL饱和硫酸铵溶液中，涡旋数秒，4°C静置过夜；将混合溶液于12000r/min再次离心15分钟，弃去上清液，收集沉淀；将上述沉淀用约100 μ L水溶解，得到溶液；使用反相键合固相萃取Millipore C4 Ziptip吸附样品溶液中的蛋白质，以80%乙腈5 μ L洗脱，得到供试品溶液；吸取供试品溶液0.5 μ L，点样，再取饱和3，5- 二甲氧基-4-羟基肉桂酸基质溶液0.5 μ L，混合，挥干；将样品板载入MALD1-T0F质谱仪中进行分析。
[0018]实施例3:
将20mg僵蚕粉碎，得细粉，加入1200 μ L水，超声提取30分钟，12000r/min离心15分钟；将上清液缓慢加入60mL饱和硫酸钱溶液中，涡旋数秒，4°C静置过夜；将混合溶液于12000r/min再次离心15分钟，弃去上清液，收集沉淀；将上述沉淀用约100 μ L水溶解，得到溶液；使用反相键合固相萃取Millipore C4 Ziptip吸附样品溶液中的蛋白质，以90%乙腈5 μ L洗脱，得到供试品溶液；吸取供试品溶液0.5 μ L，点样，再取饱和3，5- 二甲氧基-4-羟基肉桂酸基质溶液0.5 μ L，混合，挥干；将样品板载入MALD1-T0F质谱仪中进行分析。
[0019]检测试验例:
1、材料
1.1仪器
ABI 4800 MALD1-T0F生物质谱仪，Ultra Sonik 57H数控超声波清洗器，SIEMENS自动超纯水器，B1frontier AX26电子天平，Eppendorf 5415R离心机。
[0020]1.2药品与试剂
色谱纯乙腈，色谱纯三氟乙酸，3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸，硫酸铵，Millipore C4Ziptip，Applied B1system Opt1-TOF 384 样品板。
[0021]2、仪器条件
2.1 MALD1-T0F检测参数 Accelerating Voltage:25kV Grid Voltage%:95%
Guide Wire Voltage%:0.15%
Delay Time:450nsecInput Bandwidth:25MHzDigitizer Binsize:lnsecMass range:5000-100000Low Mass Gate: 10DaShots/Spectrum:1000Intensity:6000
2.2鉴走结果
典型MALD1-TOF质谱图如图1所示；僵蚕蛋白质的质荷比(m/z)信号的位置直接由质谱仪自带软件标出，主要包括:14803，14950，27801和39576四个峰，其中m/z 14803的丰度最高，m/z 39576的丰度最低，表明僵蚕蛋白质的分子量主要介于10 kDa?40 kDa之间，并且m/z为14803的蛋白质更易于离子化或者含量较其他蛋白质高。本发明中的检测方法可直接、全面简便地测定僵蚕蛋白质的分子量，比SDS-PAGE技术更为准确、快速，具有高通量特点，为中药僵蚕的质量控制提供了一种新的方案。
【主权项】
1.一种利用生物质谱技术快速检测僵蚕蛋白质的方法，其特征在于，按照下述步骤进行: (1)制备僵蚕供试品溶液； (2)利用质谱仪进行检测:吸取供试品溶液，样品板中点样，再取饱和3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸基质溶液，混合，挥干；将样品板载入质谱仪中进行分析，利用生物质谱技术快速检测。2.根据权利要求1所述的一种利用生物质谱技术快速检测僵蚕蛋白质的方法，其特征在于，所述吸取供试品溶液0.5~1 μ L ;所述取饱和3，5- 二甲氧基-4-羟基肉桂酸基质溶液的量与供试品溶液量相同。3.根据权利要求1所述的一种利用生物质谱技术快速检测僵蚕蛋白质的方法，其特征在于，所述质谱仪为MALD1-TOF。4.如权利要求1所述僵蚕供试品溶液的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行: (1)将僵香粉碎，得细粉，加入适量水，超声提取，尚心后取上清液； (2)将上清液缓慢加入饱和硫酸钱水溶液中，涡旋数秒，4°C静置过夜； (3)将混合溶液再次离心，弃去上清液，收集沉淀； (4)将上述沉淀用适量水溶解，得到样品溶液； (5)使用反相键合固相萃取C4Ziptip吸附样品溶液中的蛋白质，以乙腈洗脱，得到僵蚕供试品溶液。5.根据权利要求4所述的僵蚕供试品溶液的制备方法，其特征在于，步骤(I)中所述的僵蚕细粉与加入水的量的比例为Img:10-60 μ L ;所述超声提取时间为30分钟。6.根据权利要求4所述的僵蚕供试品溶液的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述加入饱和硫酸钱水溶液的量与步骤(I)中加入水的量体积比为30-50:1。7.根据权利要求4所述的僵蚕供试品溶液的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述乙腈浓度为70%~90%，用量为5~10 μ L08.根据权利要求4所述的僵蚕供试品溶液的制备方法，其特征在于，步骤(I)和步骤(3)中所述离心条件均为12000r/min离心15分钟。
【专利摘要】本发明涉及一种利用生物质谱技术快速检测僵蚕蛋白质的方法，属于中药技术领域；本发明首先将僵蚕粉碎后加入水，超声提取后离心取上清液加入饱和硫酸铵水溶液中，涡旋静置过夜；然后离心收集沉淀；将沉淀用水溶解，得样品溶液；使用反相键合固相萃取C4？Ziptip吸附样品溶液中的蛋白质，乙腈洗脱，得僵蚕供试品溶液；然后采用MALDI-TOF质谱仪检测僵蚕蛋白质，发现僵蚕蛋白质的分子量主要介于10？kDa~40？kDa之间，且m/z为14803的蛋白质易于离子化或含量较其他蛋白质高；本方法操作简便、快速、单次分析样品多、测定分子量范围宽、测定结果准确、重复性好，而且样品处理简便、消耗少、可分析不同来源、批次的动物药僵蚕中的蛋白质，为动物药僵蚕的准确鉴定提供了具体方法。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/72
【公开号】CN105203677
【申请号】CN201510665772
【发明人】沈玉萍, 杨欢, 徐莹, 余江南, 陈慧卿, 曹进, 夏国华
【申请人】江苏大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年10月16日