臭、口腔溃 疡、早产、低出生体重、糖尿病、呼吸系统疾病、心脏病、脑卒中、菌血症、全身健康问题以及 它们的组合。
[0056] 样品收集和储存
[0057] 根据具体的状况，所述口腔样品，优选地为牙齿、假牙（当存在时）、齿龈和舌表 面的生物膜形式，可选自唾液样品、牙斑样品、舌背样品、舌苔样品、粘膜样品以及它们的组 合。牙斑样品可来自各种位置。例如，所述牙斑样品可选自龈上牙斑样品、龈下牙斑样品、 牙齿牙斑样品以及它们的任何组合。所述样品的选择对于鉴定生物标记的准确性是至关重 要的。例如，据信与唾液微生物群相比，牙斑微生物群对齿龈炎更敏感。因此，就齿龈炎而 言，口腔样品优选地是牙斑样品。
[0058] 只要疾病可以被消除或减少，就可通过任何方法实现所述疾病的治疗。例如，在治 疗学上有效的方案后，可对受试者施用治疗学上有效量的药剂和/或治疗剂。在具体的实 施例中，为受试哺乳动物提供了能够消除或减少病害或状况的优质牙膏和特别的牙刷。受 试者被要求特定周期（例如两周）内每天刷牙两次。
[0059] 只要所述疾病可复发，就可通过任何方法实现所述疾病的复发。在大多数情况下， 对受试者身体的病害相关部分什么都不做就能使所述疾病复发。例如，就齿龈炎而言，受 试者可简单地遵循以下方案：受试者不进行任何口腔卫生操作，其包括刷牙、用任何产品漱 口，使用牙线和牙病预防。任选地，受试者可在就寝时间使用糖类或其它合适的细菌食物。 口腔细菌过夜利用所述糖类并产生升高水平的细菌代谢物。
[0060] -旦采集，所述样品可立即用于后续步骤。另选地，所述样品可置于冷冻机中 供今后使用。在一些情况下，将新采集的样品立即低温冷冻，通常低于-20°C，优选地低 于-50°C，更优选地低于-70°C，并且最优选地低于-90°C。样品保持冷冻状态，直到准备分 析。
[0061] 微牛物群落分析
[0062] 口腔存在着各种不同的、丰富而复杂微生物群落。高度多样的微生物区系栖息于 正常口腔的各种表面。细菌同时聚积在硬质和软质口腔组织上的生物膜中。对于口腔细菌， 细菌粘附是尤其重要的。
[0063] 口腔细菌已经进化出机制以感测其环境并逃避或修饰宿主。细菌占据的齿面和齿 龈的上皮提供的生态位。直到最近，根据多个单一菌株相互作用来考虑宿主和口腔细菌之 间缔合。然而，越来越明显的是口腔微生物包含复杂的群落，口腔健康或疾病取决于宿主和 作为一个整体的微生物群落之间的相互作用。虽然继续研究特定微生物的致病特性是重要 的，但只有在它们驻留其中的群落特性的语境下这些才是相关的。理解驱动疾病或健康的 微生物群落是防治微生物相关疾病的关键。
[0064] 用于跟踪和诊断宿主状况（疾病、饮食等等）的人微生物群的可能性依赖于并受 制于在群体水平上微生物群和状况之间联系的异质性程度。在肠道中，宿主间微生物群结 构的变化似乎主宰了状况间的变化（例如瘦或肥胖，或采用正常或高脂肪饮食）。然而，现 在本发明的发明人惊讶地发现对于口腔微生物群相反的情况看起来是对的，在受试者内健 康的和疾病的口腔微生物群之前的差异大于个体间差异。虽然响应的在不同的身体内栖息 的微生物群落大小差异的机制未知，但发明人的发现表明作为针对口腔以及或许甚至系统 疾病的生物标记，口腔微生物群可能具有某些优势。
[0065] 因此，根据本发明，对在三个不同时间点的口腔样品（其代表自然疾病状态、健康 状态和疾病复发状态）进行测量和对比以鉴定与状况具有统计显著性的丰度相关性的那 些微生物类型，其中所述状况选自：疾病的存在、疾病的严重性、疾病的敏感性以及它们的 组合。
[0066] 可使用许多技术来测量所述口腔样品以获取口腔微生物群落结构、功能和动态数 据。在一方面，通过选择特定微生物群体，可使用基于培养的方法来调查自然和人类活动影 响的环境中的微生物生态学。表征微生物生态学的标准培养技术涉及分离和使用商业生长 培养基（诸如Luria-Bertani培养基、NutrientAgar和TrypticSoyAgar)表征微生物。 基于培养的技术的主要限制条件是通过显微镜观察到的任何环境中>99%的微生物不能通 过标准培养技术培养。另一方面，随着近来基因组学和测序技术的进展，已经发现了多种不 依赖培养的基于对来自样品的核酸、蛋白和脂类直接分离和分析的分子方法，揭示了微生 物群落的结构和功能信息。分子方法（诸如遗传指纹分析、宏基因组学、宏蛋白组学、宏转 录组学和蛋白质基因组学）对于发现和表征庞大的微生物的多样性和理解它们与生物的 和非生物的环境因素的相互作用是至关重要的。
[0067] 根据具体的实施例，通过一种或多种方法测量所述口腔样品，所述方法选自16S rRNA(核糖核酸）分析、遗传指纹分析、克隆文库方法、变性或温度梯度凝胶电泳、随机扩 增多态性DNA(脱氧核糖核苷酸）、DNA扩增指纹图谱、扩增核糖体核酸限制性分析、DNA芯 片、荧光原位杂交、DNA-DNA杂交、宏基因组学、宏蛋白组学、宏转录组学、蛋白基因组学、 Luria-Bertani培养基分离技术、NutrientAgar分离技术、TrypticSoyAgar分离技术 以及它们的任何组合。微生物群落的分子分析显示出可培养的级分代表了任何给定样品 中存在的原核菌种总数的〈1%。这些分析方法的组合可提供更全面的微生物多样性评估。 优选地，本发明中使用了选自16SrRNA分析、宏基因组学和它们的组合的一种方法来测量 所述所述口腔样品以获取在所述口腔微生物群落中一种或多种微生物类型的丰度。最优选 地，使用16SrRNA分析来研究所述口腔样品的微生物群落。
[0068] 根据具体的实施例，通过上述一种或多种方法获取所述口腔样品的口腔微生物群 落中一种或多种微生物类型的丰度。
[0069] 根据具体的实施例，所述微生物类型选自细菌的分类种类、微生物的功能种类以 及它们的组合。更具体地和优选地，所述微生物类型选自细菌门、细菌目、细菌科、细菌纲、 细菌属、细菌种、微生物的功能基因、微生物基因同源组、微生物的肽或蛋白质的基序、微生 物的保守的肽或蛋白质域、微生物的非编码核苷酸序列以及它们的组合，优选细菌属。
[0070] 可启动本发明通过尝试尽可能多的微生物类型以确定哪种微生物类型最能满足 目的。例如，可分别鉴定细菌门、细菌属和细菌种，并分别对其丰度定量。在三个不同时间 点的样品间能根据所述微生物类型的丰度的显著差异进行鉴定，使得对所述微生物群落变 化进行鉴定以研究疾病的病因。因此，本文出于实现本发明的目的将选择据信在三个不同 时间点的丰度显著变化的一种或多种微生物类型。
[0071] 根据本发明，通过成对比较分析或多变量分析、跨测试哺乳动物组统计分析所述 微生物类型的丰度，以鉴定其丰度与该组测试哺乳动物的状况具有统计显著性的相关性的 那些微生物类型为第一组微生物类型，其中所述状况选自：疾病的存在、疾病的严重性、对 疾病的敏感性以及它们的组合。
[0072] 多变量分析选自主成分分析、主坐标分析、对应分析、降趋对应分析、聚类分析、判 别分析、典型判别分析以及它们的组合，优选主成分分析。主成分分析（PCA)是一种数学 过程，其使用一个正交转换，将一组可能相关的变量的观测值转化为一组线性相非关变量 (称为主成分，PC)的值。主成分的数量小于或等于初始变量的数量。这种变换是这样定义 的：第一主成分（PC1)具有最大的方差（即，占尽可能多的数据的可变性），每一个后续成 分在其正交于（即与之不相关）之前的组分的约束下依次具有最高可能的方差。只有当数 据集是共同垂直分布的情况下，主成分保证是独立的。主成分分析法对初始变量的相对比 例敏感。
[0073] 在具体的实施例中，统计显著性水平为p〈0. 05,优选地p〈0. 01，并且更优选地 p<0. 001〇
[0074] 鉴宙牛物标iP,的方法
[0075] 本发明的一个方面提供了鉴定指示受试哺乳动物的状况的生物标记的方法，其包 括以下步骤：
[0076]a)选择具有第一疾病的第一组测试哺乳动物；
[0077] b)获取第一口腔样品，所述第一 口腔样品包含来自具有第一疾病的第一组测试哺 乳动物中的每一个哺乳动物的第一微生物群落，其中所述第一微生物群落包含一种或多种 微生物类型；
[0078]c)治疗已进行第一口腔取样的具有第一疾病的第一组测试哺乳动物中的每一个 哺乳动物，以便消除或减少第一疾病；
[0079] d)获取第二口腔样品，所述第二口腔样品包含来自已进行治疗的第一组测试哺乳 动物中的每一个哺乳动物的第二微生物群落，其中所述第二微生物群落包含一种或多种微 生物类型；
[0080] e)使第一疾病在已进行第二口腔取样的第一组测试哺乳动物中的每一个哺乳动 物中复发；
[0081 ]f)获取第三口腔样品，所述第三口腔样品包含已复发第一疾病的第一组测试哺乳 动物中的每一个哺乳动物的第三微生物群落，其中所述第三微生物群落包含一种或多种微 生物类型；
[0082] g)测量所述第一口腔样品、第二口腔样品和第三口腔样品以分别获得在第一微生 物群落、第二微生物群落和第三微生物群落中的一种或多种微生物类型的丰度；
[0083] h)对获得的在跨第一组测试哺乳动物的第一微生物群落、第二微生物群落和第 三微生物群落中的一种或多种微生物类型的丰度进行统计学分析，以鉴定其丰度与第一组 测试哺乳动物的状况具有统计显著性的相关性的那些微生物类型为第一组微生物类型，其 中所述状况选自：第一疾病的存在、所述疾病的严重性、对所述疾病的敏感性以及它们的组 合；
[0084] i)从所述第一组微生物类型中选择一种或多种作为指示所述受试哺乳动物的状 况的生物标记。
[0085] 根据具体的实施例，在步骤h)中，用成对比较分析对获得的第一微生物群落、第 二微生物群落和第三微生物群落中的一种或多种微生物类型的丰度进行统计学分析，其包 括以下步骤：
[0086] 1)将所述第一组测试哺乳动物中的每一个哺乳动物的所述第一微生物群落和所 述第二微生物群落进行比较，以测定所获得的在所述第一微生物群落和所述第二微生物群 落之间每种微生物类型的丰度的变化；
[0087] 2)将获得的来自步骤1)跨第一组测试哺乳动物的每种微生物类型的丰度的变化 进行比较，以选择表现出统计意义上的显著性的丰度变化的那些微生物类型作为微生物类 型的初级组；
[0088] 3)将所述第一组测试哺乳动物中的每一个哺乳动物的所述第二微生物群落和所 述第三微生物群落进行比较，以测定所获得的在所述第二微生物群落和所述第三微生物群 落之间每种微生物类型的丰度的变化；
[0089] 4)将获得的来自步骤3)跨第一组测试哺乳动物的每种微生物类型的丰度的变化 进行比较，以选择表现出统计意义上的显著性的丰度变化的那些微生物类型作为微生物类 型的次级组；以及
[0090] 5)将微生物类型的初级组和微生物类型的次级组进行比较，以鉴定出那些重叠的 微生物类型作为第一组微生物类型。
[0091] 根据另一个具体的实施例，在步骤h)中，用多变量分析对获得的第一微生物群 落、第二微生物群落和第三微生物群落中的一种或多种微生物类型的丰度进行统计学分 析，其包括以下步骤：
[0092] 1)将所获得的所述第一微生物群落、第二微生物群落和第三微生物群落中的一种 或多种微生物类型的丰度正交转换，以导出占所获得的丰度中方差最大的向量；以及
[0093] 2)鉴定出具有表现出与导出的向量有统计意义上的显著的相关性的获得的丰度 的那些微生物类型作为第一组微生物类型。
[0094] 有趣的是，本发明人的研究也阐明了微生物与哺乳动物群体中疾病结果的异质性 的联系，其使得有可能基于微生物生态学将所述哺乳动物群体分成疾病敏感的哺乳动物和 疾病较不敏感的哺乳动物。不受任何理论的束缚，发现疾病敏感的哺乳动物的特征在于：与 疾病较不敏感的哺乳动物相比，从健康状态到疾病状态微生物群落结构的变化更剧烈。
[0095] 因此，根据另一个具体的实施例，在步骤h)中，用多变量分析对获得的第一微生 物群落、第二微生物群落和第三微生物群落中的一种或多种微生物类型的丰度进行统计学 分析，其包括以下步骤：
[0096] 1)将所获得的所述第一微生物群落、第二微生物群落和第三微生物群落中的一种 或多种微生物类型的丰度正交转换，以导出占所获得的丰度中方差最大的向量；
[0097] 2)将获得的第一组测试哺乳动物中的每一个哺乳动物的第一微生物群落、第二微 生物群落和第三微生物群落中的每一种的一种或多种微生物类型的丰度投影至导出的变 量上，以获得针对第一组测试哺乳动物中的每一个哺乳动物的第一微生物群落、第二微生 物群落和第三微生物群落的每一种的投影值；
[0098] 3)针对第一组测试哺乳动物的每一个计算跨第一微生物群落、第二微生物群落和 第三微生物群落的投影值的变化速率；
[0099] 4)基于所计算出的变化速率，将第一组测试哺乳动物分成测试哺乳动物的第一子 组和测试哺乳动物的第二子组，其中所述测试哺乳动物的第一子组与测试哺乳动物的第二 子组相比，表现出更大的变化速率；以及
[0100] 5)分别将测试哺乳动物的第一子组的第一微生物群落、第二微生物群落和第三微 生物群落与测试哺乳动物的第二子组的第一微生物群落、第二微生物群落和第三微生物群 落进行比较，以鉴定第一微生物群落、第二微生物群落和第三微生物群落中的每一种中丰 度在测试哺乳动物的第一子组和测试哺乳动物的第二子组间具有有统计意义上的显著差 异的那些微生物类型，作为第一组微生物类型。
[0101] 根据另一个实施例，本发明方法还包括以下步骤：
[0102] 1)选择具有第二疾病的第二组测试哺乳动物；
[0103] 2)重复步骤b)至h)以鉴定第二组微生物类型；
[0104] 3)将第一组微生物类型和第二组微生物类型进行比较，以鉴定出那些重叠的微生 物类型作为微生物类型的子组；以及
[0105] 4)从所述微生物类型的子组选择一种或多种微生物类型作为指示所述受试哺乳 动物状况的生物标记，其中所述状况选自：第一疾病和第二疾病的存在、第一疾病和第二疾 病的严重性、对第一疾病
[0106] 和第二疾病的敏感性以及它们的组合。
[0107] 用于鉴宙牛物标iP,的计筧机辅助系统
[0108] 根据本发明，提供了有助于实施本发明的所述方法的计算机辅助系统。鉴定指示 受试哺乳动物的状况的生物标记的本计算机辅助系统包括：
[0109]a)用于取样的取样部分：
[0110] 1)第一口腔样品，所述第一口腔样品包含来自具有疾病的一组测试哺乳动物中 的每一个哺乳动物的第一微生物群落，其中所述第一微生物群落包含一种或多种微生物类 型，
[0111] 2)第二口腔样品，所述第二口腔样品包含来自已进行治疗以消除或减少所述疾病 的该组测试哺乳动物中的每一个哺乳动物的第二微生物群落，其中所述第二微生物群落包 含一种或多种微生物类型，和
[0112] 3)第三口腔样品，所述第三口腔样品包含已复发所述疾病的该组测试哺乳动物中 的每一个哺乳动物的第三微生物群落，其中所述第三微生物群落包含一种或多种微生物类 型；
[0113] b)与取样部分相联的测量部分，其中所述测量部分被配置用于测量第一 口腔样 品、第二口腔样品和第三口腔样品，以分别获得在第一微生物群落、第二微生物群落和第三 微生物群落中的一种或多种微生物类型的丰度；和
[0114] c)与测量部分相联的计算部分，其中所述计算部分被配置用于接收并对所获得 的在跨该组测试哺乳动物的第一微生物群落、第二微生物群落和第三微生物群落中的一种 或多种微生物类型的丰度进行统计学分析，以鉴定其丰度与该组