用于免疫印迹的微流体装置的制造方法
【专利说明】用于免疫印迹的微流体装置
[0001]本申请要求在2013年3月12日提交的美国临时专利申请61/777，682的优先权，所述申请以整体引用的方式并入本文。
[0002]领域
[0003]本发明提供用于在免疫印迹应用中使用的微流体装置、系统和方法。具体而言，本文提供的装置和方法具有传统蛋白质印迹的优点，同时具有增加的生产量和多重能力以及减少的时间、样品和试剂需求。
[0004]背景
[0005]传统蛋白质印迹分析(或免疫印迹)用于检测细胞、组织、器官、体液等中的特定的蛋白质。该技术是生物化学和分子生物学的支柱。样品中的蛋白质通过凝胶电泳(例如，SDS-PAGE)分离并且然后从凝胶转移到膜(例如，硝化纤维素或PVDF)。然后将膜用对靶蛋白特异的抗体染色。虽然可靠地产生有用的信息，但所述技术:耗时、需要专门技术、试剂密集型、有限的生产量并且不太适用于多重性。需要的是提供传统蛋白质印迹的优点，同时具有增加的生产量、多重能力和减少的试剂使用的技术。
[0006]发明概述
[0007]本发明提供用于在免疫印迹应用中使用的微流体装置、系统和方法。具体而言，本文提供的装置和方法具有传统蛋白质印迹的优点，同时具有增加的生产量和多重能力以及减少的时间、样品和试剂需求。
[0008]在一些实施方案中，本发明提供一种微流体免疫印迹装置，其包括平的膜接触表面和多个非连接的平行微流体通道，其中所述微流体通道的长度对膜接触表面是开放的。在一些实施方案中，微流体通道在空间上被分成两个或更多个通道组。在一些实施方案中，两个或更多个通道组的每个包括2-20微流体通道。在一些实施方案中，分离微流体通道与通道组的距离小于通道组之间的距离。在一些实施方案中，微流体通道(例如，微流体通道的每个)包括在微流体通道的一端的储蓄池。在一些实施方案中，微流体通道(例如，微流体通道的每个)包括在微流体通道的两端的储蓄池。在一些实施方案中，每个微流体通道是50-300 μm宽。在一些实施方案中，每个微流体通道是100-200 μm宽。在一些实施方案中，每个微流体通道是140-160 μ m宽。在一些实施方案中，每个微流体通道是30-200 μ m深。在一些实施方案中，每个微流体通道是50-150 μm深。在一些实施方案中，每个微流体通道是90-110 μπι深。在一些实施方案中，微流体通道的宽度与深度的比小于10:1(例如，〈9:1、〈8:1、〈7:1、〈6:1、〈5:1、〈4:1、〈3:1、〈2:1)。在一些实施方案中，微流体通道的宽度与深度的比在3:1至1:3之间(例如，2:1至1:2)。在一些实施方案中，微流体通道的宽度与深度的比是 9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或1:9。在一些实施方案中，微流体通道的宽度与深度的比在3:1至1:3之间(例如，2:1至1:2)。在一些实施方案中，所述装置包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)。在一些实施方案中，所述装置基本由聚二甲基硅氧烷(PDMS)组成。在一些实施方案中，本发明提供免疫印迹的方法，所述方法包括使用本发明的装置将抗体溶液施用于膜。
[0009]在一些实施方案中，本发明提供包括本发明的装置和膜的系统(例如，分析)。在一些实施方案中，激活溶液被定位或放置在所述的装置和所述的膜之间。在一些实施方案中，所述激活溶液包含聚山梨醇酯-20 (Tween-20)和BSA。在一些实施方案中，所述激活溶液包含0.01-0.5%的Tween-20和0.01-0.5%的BSA。在一些实施方案中，所述激活溶液包含0.05-0.15%的Tween-20和0.05-0.15%的BSA。在一些实施方案中，所述激活溶液包含0.1 %的Tween-20和0.1 %的BSA。在一些实施方案中，所述膜包含膜硝化纤维素或聚偏二氟乙烯(PVDF)。在一些实施方案中，所述膜包括在膜上或在膜内的肽、多肽或蛋白质。在一些实施方案中，系统还包括在微流体通道内的一种或多种含抗体溶液。在一些实施方案中，通道组的每个微流体通道包括不同的含抗体溶液。在一些实施方案中，每个通道组包括含抗体溶液的相同的组合。在一些实施方案中，每个微流体通道包括不同的含抗体溶液。在一些实施方案中，本发明提供免疫印迹的方法，所述方法包括使用本发明的系统将抗体溶液施用于膜。
[0010]在一些实施方案中，本发明提供免疫印迹的方法，其包括:(a)将蛋白质从样品转移至膜上；(b)将微流体免疫印迹装置的膜接触面放置在膜上；(c)将激活缓冲液引入(例如，注射)所述装置的微流体通道中；(d)将一抗溶液引入(例如，注射)所述装置的微流体通道中；并且(e)检测所述抗体溶液中的抗体与所述蛋白质的结合。
[0011]附图简述
[0012]图1示出微流体免疫印迹装置和与膜的对接的示意图。三个微流体通道覆盖在每个样品泳道上，可用于探测每个泳道三种不同的蛋白质。
[0013]图2示出在临床PBMC样品中的抗体稀释液。㈧利用针对RelA/p65的一抗的传统免疫印迹，使用1:500至1:5000的抗体稀释液。⑶使用相同的条件探测RelA/p65的微流体免疫印迹，如展示了相似的信号强度和对同一样品制备若干稀释液的灵活性。
[0014]图3示出对响应于炎性刺激的STAT3磷酸化作用的检测。(A)RAW264.7细胞裂解液的传统免疫印迹，示出响应于LPS刺激的STAT3的磷酸化作用。⑶在与(A)相同的RAW264.7细胞裂解液上的微流体免疫印迹。所述微流体装置允许在同一样品中同时监测磷酸-STAT3和STAT3而不需要剥离或重新探测PVDF膜。
[0015]图4示出利用两种不同的化学发光检测形式的MAPK通路的蛋白质免疫印迹。(A)RAW264.7细胞裂解液的传统免疫印迹，有或没有LPS，保持45分钟。使用总ERK作为上样对照，探测膜的磷酸-JNK和磷酸-ERK。使用HRP化学发光技术检测一抗。(B)反映(A)中的条件的微流体免疫印迹。(C)和(D)与(A)和(B)相同，除了它们使用碱性磷酸酶化学发光二抗来进行以检测一抗。
[0016]定义
[0017]本文的术语“抗体”以最广泛的意义使用并且具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展现出期望的生物活性(Miller等(2003) Jour, of Immunology 170:4854-4861 ;其以整体引用的方式并入本文)。抗体可以是鼠的、人的、人源化的、嵌合的或衍生自其他物种。抗体是由免疫系统生成的能够识别并结合特定抗原的蛋白质。(Janeway, C、Travers, P, ffalport, M, Shlomchik (2001) Immuno B1logy，第 5 版，Garland Publishing, New York ;以整体引用的方式并入本文)。靶抗原通常具有多个结合位点，也称作表位，其由多种抗体上的CDR识别。特异性结合不同表位的每一抗体具有不同结构。因此，一种抗原可具有不止一种的对应抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免疫特异性地结合所感兴趣的靶标抗原或其部分的抗原结合位点的分子，这些靶标包括但不限于癌细胞或产生与自体免疫疾病相关的自身免疫抗体的细胞。免疫球蛋白可以是任何类型(例如，IgG, IgE, IgM, IgD 和 IgA)、类别(例如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或免疫球蛋白分子的亚类。免疫球蛋白可以来源于任何物种，包括人、鼠或兔源。
[0018]如本文所用，术语“抗体片段”指全长抗体的一部分，一般是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗-1d)抗体、CDR(互补决定区)以及免疫特异性地结合抗原的任何上述项的表位结合片段。
[0019]如本文所用，短语“多重的”或语法等效物指所感兴趣的多于一个靶序列的检测、分析或扩增。在一个实施方案中，多重的指>3、>5、>8、>10、>20、>50、>100等。“多重能力”指以多重方式使用的特定设备、试剂、系统、平台、试剂盒等的质量。
[0020]如本文所用，术语“样品”以其最广泛的意义使用。在某种意义上，其意图包括细胞(例如，人、细菌、酵母和真菌)、有机体、从任何来源获得的试样或培养物，以及生物和环境样品。生物样品可从动物(包括人)获得并且指在其中发现的生物材料或组合物，包括但不限于骨髓、血液、血清、血小板、血浆、组织间液、尿液、脑脊液、核酸、DNA、组织以及其纯化或过滤形式。环境样品包括环境材料如地表物质、土壤、水、晶体和工业样品。然而，这些实例不能理解为限制适用于本发明的样品类型。
[0021]本发明实施方案详述
[0022]本发明提供用于在免疫印迹应用中使用的微流体装置、系统和方法。具体而言，本文提供的装置和方法具有传统蛋白质印迹的优点，同时具有增加的生产量和多重能力以及减少的时间、样品和试剂需求。
[0023]自1979年问世以来，蛋白质免疫印迹已成为分子生物学和临床诊断学中用于分析蛋白质的标准技术(Towbin等1979;其以整体引用的方式并入本文)。虽然传统蛋白质免疫印迹仍为强大的技术，但这种技术具有局限性，包括其缓慢生产量、对于相对大的样品和抗体量的需求和无法同时探测多种蛋白质(Wu等，2007 ;以整体引用的方式并入本文)。
[0024]为克服一些早期局限性，已经演化出蛋白质免疫印迹的若干变型，包括允许不同蛋白质的连续检测的膜剥离和重新探测，和荧光二抗的引入，所述荧光二抗可用于增加从样品检测到的不同蛋白质。尽管取得改进，但是这些变型具有其自身的局限性，包括信号缺失和信号可变性。另外，这些变型都没有解决传统免疫印迹所需较大样品和抗体量的问题。
[0025]微流体技术已应用于分子生物学和临床诊断学。通过微流体提供的小体积和精确的空间控制使其成为对现存的分子生物技术的一个令人兴奋的弥补。Herr小组将微流体技术与传统蛋白质免疫印迹进行了结合(He和Herr 2009，Hughes和Herr 2012，以整体引用的方式并入本文)。虽然取得改进，但这种方法仅可检测单一的蛋白质并且不具有对接现存的免疫印迹平台的灵活性。最近，已开发出使免疫印迹的分离、转移和检测部件整合到单个设备中的微流体装置(Tia等2011 ;以其整体引用的方式并入本文)。虽然此装置的速度和多重能力显著增强，但利用此类整合的微流体装置探测复杂生物基质中的特定蛋白质的能力仍未得到证明。Pan和同事通过引入基于荧光的微流体装置做了进一步改进，所述装置可检测多种蛋白质并且与现存的蛋白质免疫印迹方法是兼容的(Pan等2010 ;以整体引用的方式并入本文)。这些微流体装置都不允许同时探测多种蛋白质并且都不能对接现有的免疫印迹设备和化学发光检测方法。
[0026]虽然传统蛋白质印迹可产生重要的信息(例如，关于生物系统(例如，人)与外部刺激(例如，抗炎药)之间的相互作用))