微流体装置的制作方法

本申请要求享有2014年4月9日申请的新加坡专利申请No.10201401377X的优先权，它的内容通过整体引用被结合于此以用于各种目的。

技术领域

本发明涉及生物化学和生物医学工程领域，特别涉及用于检测生物化学分子的微流体装置。

背景技术：

聚合酶链反应(PCR)是用于核酸扩增和基因检测的成熟方法。该方法通常是在诸如PCR管和孔板之类的装置中进行。但是，针对基于微流体芯片的PCR装置的研究日益增多，以用于各种应用，包括食品安全试验，环境监视和即时临床诊断。与常规装置相比，基于微流体/纳流体芯片的PCR系统具备许多优势，诸如操作快，样品体积小，样品易于输送到分析段并且在多个孔中平行扩增。微流体PCR装置的一个这样的实施例是具有3个PCR反应孔的盒上实验室系统。为了进一步加强本实施例的系统的检测能力，已经开发出了具有更多孔的PCR芯片，努力满足各种应用之需，诸如癌症和传染病诊断，其中可以有10个以上的目标。

微流体PCR平台可以被分为三类：腔室静止的PCR系统，连续流动的PCR系统和热对流驱动的PCR系统。其中，腔室静止的PCR系统最适合于具有高流通量的多腔室PCR扩增。但是，要在单个芯片上有效地进行聚合酶链反应有相当多的挑战要克服。例如，不容易将少量PCR混合物均匀地输送到各个腔中。此外，由于PCR腔的体积非常小，防止反应混合物在高温下(例如95℃)因蒸发而损失非常重要。另外，在聚合酶链反应过程中可能形成气泡，这会显著地影响芯片操作并降低聚合酶链反应的效率。解决这些问题最常用的方法是将泵和阀集成到用于加载和密封PCR混合物的芯片上。但是，将许多部件集成到单个芯片上使得装置的建造与操作复杂化。

一个替代方法是利用毛细作用驱动的微流体将样品加载到反应室内，用表面活性剂使PCR混合物和PCR芯片之间的接触角最小化可以实现这种方法。但是，增加的表面活性剂对PCR扩增效率通常有不良的影响。离心力是另一个选项，这是由于它易于应用于盘式微流体装置，以精确输送PCR混合物。但是，基于离心力的流体输送不太灵活，特别是当PCR部分与其他的生物样品制备部分集成时。

已经开发出PCR快速填充的不同方法。例如，已经开发出PCR阵列芯片，通过将分配通道/反应孔的表面硅烷化以增强毛细作用力来驱动流体，该阵列芯片将PCR混合物自动吸入到分配通道和反应孔内。但是，这种方法需要额外的步骤来改善表面。

防止PCR混合物损失对于基于微流体的PCR系统来说是个挑战。样品损失的三个主要原因如下：(i)在样品加载过程中圈闭在反应孔中空气在高温下膨胀，并将样品溶液推出反应孔。已经开发出几种方法以避免空气圈闭，包括改进PCR孔的形状设计，并且改变孔的表面以使它非常亲水。(ii)原来溶于PCR混合物中的气体在高温下因可溶性降低而释放；这也可能将样品溶液推出反应孔。在加载之前为PCR混合物脱气可以有助于使这一影响最小化。(iii)PCR混合物在高温下会蒸发，导致样品容积损失；在多个热循环之后这一点特别显著。为了解决这一问题，在填充各反应室之后用单独的阀来密封它们。

此外，各种细菌的快速检测是食品安全试验和临床诊断的关键。常规PCR或者反转录PCR(RT-PCR)通常用于细菌检测。但是这要忍受一个重要的缺点，即它需要快速而精确的热循环，以使目标DNA分子在反应过程中变性、延长和退火。

因此需要提供一种微流体装置和系统，以克服或者至少改善上述的一个或多个缺点。

技术实现要素：

在第一方面中，提供了一种微流体装置，包括：多个孔，每个孔包括一个充当该孔的入口和出口的开口，其中每个开口与共用流体通道流体连通，并且其中每个开口通过隔离通道与共用流体通道相连，并且所述多个孔在该装置上被布置成径向对称的图案。

在第二方面中，提供了一种系统，该系统包括：此处公开的微流体装置；布置在微流体装置上方或下方的检测装置，以在使用过程中检测由包含在孔中的可能的反应产物发射的信号。

在第三方面中，提供了一种使用此处公开的系统从液体样品中检测至少一种目标分子的方法，其中该方法依次包括：(i)用来自包含有目标分子的源头的液体样品填充多个孔；(ii)用来自密封剂源的密封剂填充共用流体通道；(iii)允许检测探针和目标分子之间在多个孔中进行反应；(iv)检测由反应产物发出的信号。

附图说明

当结合非限定性的实施例和附图考虑时，参照详细说明会更好地理解本发明，其中：

图1显示了根据本发明的一个实施方式的装置的示意图。具体地说，图1a显示了装置100的示意性的概览，图1b显示了装置100的放大的示意图，而图1c显示了孔104的横截面。图1d显示了另一个实施例，其中多个孔104在装置100上被设置成线性图案，这些孔通过隔离通道108与一个共用流体通道106流体连通。

图2a显示了根据本发明的一个实施方式的装置的示意图，该装置被连接到真空源160和管170上，该管用作包含可能的目标分子的源头。

图2b显示了图2a的装置的孔中的压力的曲线，该压力对应于注射泵160中的真空体积，在实施例2参考该图。

图3显示了根据本发明的另一个实施方式的装置的示意图，该装置被连接到真空源180、密封剂源180和包含可能的目标分子的源170。源160、170、180通过阀142、144、146连接到装置100。

图4a显示了根据本发明的一个实施方式的系统200的示意图。除了别的以外，系统200包括PCR装置100、发热元件202和光学系统210。

图4b显示了根据来自光学系统210的光的高斯正态分布的模拟结果，在实施例4中参考该图。装置100的多个孔可以以与光的分布互补的方式布置。

图5a显示了加载到装置100内的样品的照片，在实施例2中参考该图。

图5b显示了每个孔的平均填充体积对所施加的真空的曲线，在实施例2中参考该图。

图5c显示了不同孔中填充的体积对沿着流体通道的孔的位置的曲线，在实施例2中参考该图。

图6a显示了当使用的真空体积不足、小于5毫升时PCR室的照片，而图6b显示了当使用22毫升的真空体积时PCR室的照片。在实施例3a中参考图6a和图6b。

图7显示了实施例3b中的密封过程的进程的照片。

图8显示了原料RNA样品、其10倍到10,000倍的稀释液(即浓度为1.00E+01、1.00E+02、1.00E+03和1.00E+04)和阴性对照的扩增曲线，在实施例5中参考该图。

图9显示了在奥米伽PCR阵列芯片上对HPIV1和HPIV2病毒进行同步端点检测的图像，在实施例5中参考该图。

图10显示了沸点温度对不同甘油浓度的曲线，在实施例6b中参考该图。

图11显示了从约10³、10⁵、10⁷、和10⁹的细菌细胞中提取出的质粒DNA的扩增曲线，在实施例6b中参考该图。

图12a显示了在65℃下在40分钟的HDA之后捕获的端点荧光信号，在实施例6b中参考该图。

图12b显示了逐孔的信号强度对孔数目的曲线，在实施例6b参考该图。

图13显示了根据本发明的一个实施方式的集成的多合一分子诊断装置500的分解图，该装置包括PCR芯片102和样品制备盒502。

具体实施方式

在一个实施方式中，提供了一种微流体装置，包括：多个孔，每个孔包括一个充当该孔的入口和出口的开口，其中每个开口与一个共用流体通道流体连通，并且每个开口通过隔离通道与共用流体通道相连，并且所述多个孔在该装置上被布置成径向对称的图案。

公开的该装置可以是简单装置，它不涉及太多部件。因此，该装置的制造可以很经济，装置的操作也很容易。此外，该公开装置可以提高反应混合物输送和密封的速度和精确度。

该公开的装置可以包括多个孔，孔的数目根据应用的需要而定。例如，该装置可以包括约2到100个孔，或者约5到100个孔，或者约10到100个孔，或者约20到100个孔，或者约5到50个孔，或者约10到50个孔，或者26个孔，或者28个孔。在有些情况下，公开的装置很灵活，以满足各种应用之需。

每个孔的直径和深度可以调节，以适合装置的用途。每个孔的体积可以精密控制。在一些例子中，有必要减小孔的体积。

孔可以具有适于包含反应混合物的形状，诸如球形或者立方形或者灯泡形。每个孔可以具有不同的尺寸或者形状。

每个孔的体积可以在约1微升到50微升，或者约2微升到50微升，或者约3微升到50微升，或者约2微升到10微升，或者约3微升到10微升，或者落在这些范围内的任何值。包含在装置内的总液体体积可以在约2微升到1000微升之间，或者约10微升到约200微升，或者约10微升到约150微升，或者约20微升到约200微升，或者约20微升到约150微升，或者约30微升到约200微升，或者约30微升到约150微升，或者约30微升到约100微升。在一个实施例中，孔的体积被精密控制到2.99到3.09微升。在一个实施例中，公开的装置的总液体体积可以是现有技术装置中要求的总液体体积的一小部分。例如，具有10个孔的公开装置的总液体体积约为10个常规PCR管中要求的总体积的大约20％。通过再次引入从入口通道排出的过量液体，总液体体积可以进一步减小。总液体体积在这里包括孔的体积和入口通道中液体的体积。

孔的直径可以在约1毫米到4毫米之间，或者约1.5毫米到4毫米，或者约1.7毫米到4毫米，或者约2毫米到4毫米，或者约2.2毫米到4毫米，或者约2.5毫米到4毫米，或者约3毫米到4毫米，或者约1毫米到3毫米，或者约1毫米到2.5毫米，或者约1毫米到2.2毫米，或者约1毫米到2毫米，或者约1.5毫米到3毫米，或者约2毫米到3毫米，或者约2毫米到2.5毫米。孔的深度或者高度可以在约0.5毫米到1.5毫米之间，或者约0.6毫米到1.5毫米，或者约0.7毫米到1.5毫米，或者约0.8毫米到1.5毫米，或者约0.9毫米到1.5毫米，或者约1毫米到1.5毫米，或者约0.5毫米到1毫米，或者约0.5毫米到0.9毫米，或者约0.5毫米到0.8毫米，或者约0.8毫米到1毫米。在一个实施例中，孔的直径可以减少到约2毫米，孔的深度可以减小到约1毫米，以将孔的体积减少到约3微升。

当用在此处时，术语“直径”是指目标的最大长度。对于具有不规则形状的目标，直径是目标最长的横截面的长度。

每个孔包括一个开口。该开口允许进入孔内，以及从孔中退出。在一个实施例中，开口在任一给定时间可以充当入口或出口。液体通过孔的开口进入孔中。孔的开口可以通往隔离通道。因此，开口可以具有与隔离通道相同的尺寸，或者可以具有与隔离通道不同的尺寸，只要液体流不被阻止即可。

根据需要，隔离通道可以位于孔的顶部，或者孔的中部，或者孔的底部。也即，隔离通道可以允许液体进入孔的顶部、或者孔的中部、或者孔的底部。

在一个实施例中，可以允许液体快速进入孔中。在装置被用于反应的情况下，该实施例有助于将反应混合物更快地输送到孔内，以开始反应。在一些例子中，可以完全或者部分防止孔中的液体从孔中出来。隔离通道的尺寸可以相应调整。

隔离通道可以具有任意的横截面形状。可以选择隔离通道的横截面形状，以完全或者部分防止孔中的液体从孔中出来，而允许液体进入孔中。例如，隔离通道的横截面形状可以是锥形横截面或者圆形横截面或者正方形横截面。在一个例子中，隔离通道的宽度可以在约0.05毫米到约3毫米之间。隔离通道的深度可以在约0.05毫米到约3毫米之间。如果隔离通道的横截面是圆形，直径可以在约0.05毫米到约3毫米之间。在一个例子中，隔离通道的横截面尺寸可以为(约0.05-3毫米)乘以(约0.05-3毫米)。在另一个例子中，隔离通道的横截面尺寸可以为约0.5毫米乘以约0.5毫米。

液体从共用流体通道进入孔中。共用流体通道可以具有任意的横截面形状。可以选择流体通道的横截面形状，以免阻碍液体流动，例如圆形横截面或者正方形横截面。在一个例子中，流体通道的宽度可以在约0.05毫米到约3毫米之间。流体通道的深度可以在约0.05毫米到约3毫米之间。如果流体通道的横截面是圆形，直径可以在约0.05毫米到约3毫米之间。在一个例子中，流体通道的横截面尺寸可以为(约0.05-3毫米)乘以(约0.05-3毫米)。在另一个例子中，流体通道的横截面尺寸可以为约0.5毫米乘以约0.5毫米。如果通道太小，例如小于公开的尺寸，那么可能会妨碍孔的填充。另一方面，如果通道太大，例如大于公开的尺寸，可能会浪费试剂。

共用流体通道的一端或者两端可以是开口端。流体通道的开口端可以具有约0.05毫米到约3毫米之间的宽度或者深度或者直径。在一个例子中，流体通道的直径可以为约1毫米。

在一些例子中，众多孔中的至少一些或者所有孔与共用流体通道流体连通。在一些例子中，液体可以从共用流体通道依次进入孔中。在一个例子中，液体可以沿着液体流动方向完全填充与共用流体通道相连的第一孔，然后从第一孔溢流到共用流体通道内，以填充接下来的孔。在另一个例子中，如图5a所示，当液体在共用流体通道中时，许多孔可以同时被填充。

此处使用的术语“流体连通”可以是指液体或者气体的连通。此处所称的液体可以是溶液，诸如水溶液，或者混合物，诸如反应混合物。

多个孔以某种方式被布置在装置上，以便所有孔可以被基本均匀地检测到。如在下面将进一步详细描述的那样，每个孔可以包括能够与目标分子形成反应产物的检测探针。反应产物可以发出信号，公开的系统的检测装置通过例如将光照在多个孔上来检测该信号。在一些例子中，多个孔以与检测方式互补的方式被布置在该装置中，以便可能的反应产物的检测可以是基本均匀的。

在一个实施方式中，多个孔在装置中被布置成径向对称的图案。如此处使用的那样，术语“径向对称”、或者它们的语法变体，是指构成部分的布置关于特殊的轴线对称。在某些例子中，构成部分的布置关于三条以上的轴线对称，其中这些轴线相交于中心点。

在一个例子中，多个孔可以按圆形布置定位在该装置上，或者在该装置上布置成圆环。连接多个孔的共用流体通道可以形成“Ω”形状，因此可以被称为“奥米伽PCR阵列芯片”。图1a显示了这一实施方式的一个实施例。在图1d所示的另一个实施例中，多个孔在该装置上布置成线性图案，其中各孔与一个共用流体通道流体连通。

此处所用的术语“芯片”是指一般包括诸如公开的装置之类的微流体装置的基片，包括许多可以彼此互连或者可以彼此不互连的通道和室。通常，这样的芯片包括许多有源的或者无源的元件，诸如通道、阀、泵和相关的控制系统。

多个孔可以被定位在共用流体通道的任一侧。在一个实施例中，所有孔都可以在共同平面内被定位于流体通道的一侧。如果多个孔被布置成圆形回路，那么所有孔都可以被布置在回路的外缘。在另一个实施例中，第一组孔可以定位在流体通道的第一侧，而第二组孔可以定位在流体通道的沿着共同平面中的Y轴与第一侧相对的侧，如图1d所示。在又一个实施例中，一组孔或者所有孔可以关于通过共用流体通道的轴以角度B定位在径向上的任何位置，例如沿着Z轴，其中角度B为90°。每个孔相对于共用流体通道可以定位成介于约10°和约90°之间、或者45°、或者90°的角度。每个孔的隔离通道相对于共用流体通道可以以介于约10°和约90°之间、或者45°(如图1d的(i)和(ii)中所示)、或者90°(如图1d的(iii)和(iv)中所示)的角度A移动。如果多个孔被定位在共用流体通道的不同侧，相对孔的隔离通道可以定位于共用流体通道的同一点上(如图1d的(i)和(iii)中所示)。例如，共用流体通道上的一个点产生两个隔离通道(正Y轴上的一个隔离通道和负Y轴上的另一个隔离通道)，其中X轴是平行于共用流体通道的轴。在另一个实施例中，相对孔的隔离通道被定位在共用流体通道的不同点或者交错点上(如图1d的(ii)和(iv)所示)。例如，共用流体通道上的一个点在正Y轴上产生一个隔离通道，而共用流体通道上的另一个点在负Y轴上产生另一个隔离通道，其中X轴是平行于共用流体通道的轴。

根据本发明的一个实施方式的公开装置的一个实施例如图1a，1b和1c所示。图1显示了装置100的示意性的概览图。图1b显示了装置100的放大的示意图。图1c显示了孔104的横截面。

装置100包括基片102，基片包括多个孔洞104，这些孔洞将被光学粘膜110封闭在顶部和底部(如图1c所示)，以便孔洞104充当孔。相应地，装置100具有“夹心”结构。基片102用1.5毫米厚的聚碳酸酯(PC)制成。用两片0.1毫米厚的光学粘膜110密封基片102的顶部和底部，形成封闭孔104。装置100包含26个孔，均匀地定位在圆形的共用流体通道106的外侧。每个孔104具有2.0毫米的直径和1.0毫米的深度，对应于约3微升的样品容积。各孔经0.5毫米宽、0.5毫米深的隔离通道108与共用流体通道106相连。用于输送液体到各个孔104的共用流体通道106分别具有0.5毫米的宽度和0.5毫米的深度。在共用流体通道106的两端，有两个直径1毫米的孔112a、112b，它们将分别与入口管和出口管相连(未显示)。液体从112a沿着箭头A所示的方向被输送到孔104。图1c显示预装有引物114的孔104。

共用流体通道的第一端可以被构造成与将被引入该装置中的流体流体连接。引入该装置中的流体取决于装置的用途。如果该装置被用于进行聚合酶链反应，共用流体通道的第一端可以被构造成与以下源中的一个或多个流体连接：包括可能的目标分子的源、密封剂源、洗涤剂源和用于聚合酶链反应的试剂的其他源。共用流体通道的第一端还可以被构造成与正压源流体连接，以帮助引入流体。如果一个以上的源将被连接到流体通道的第一端，那么在流体通道的第一端处，连接可以分支也可以汇合。在另一个实施例中，每个源都可以直接连接到第一端，也可以在汇合到流体通道第一端之前连接到分支连接。

共用流体通道的第二端可以构造成与真空源流体连接。真空源可以直接连接到第二端，也可以在流体通道第二端汇合之前连接到分支连接。由真空源产生的真空可以帮助从流体通道的第一端抽或者拉流体到流体通道的第二端。如果一个以上的源将被连接到流体通道的第一端，那么在流体通道的第一端处，连接可以分支，也可以汇合。

换句话说，流体通道的第一端可以配置成把流体推入通道，第二端可以配置成将流体拉过通道。

从各种源的每个分支或者每个连接都可以由一个或多个阀分别控制。

在流体通道的一端将被要么直接要么通过分支连接到一个源的情况下，可以提供一个或多个阀，以调节源的流动或者在不同分支之间切换。在流体通道的一端将被连接到一个以上的源的情况下，其中每个源要么直接要么通过分支连接，可以在每个连接上提供一个或多个阀，以调节源的流动或者在不同分支之间切换。

阀可以是电磁阀或者旋转阀。阀的控制可以自动，藉此便于在该装置内输送各种流体。真空源可以自动化，以提供预定真空压力。真空源可以通过反馈回路与阀相连。因此，公开的装置、系统和方法可以完全自动化。

可以防止液体接触真空源。相应地，在某些情况下，一个或多个液体流动封堵器被连接在流体通道的第二端和真空源之间。在一个实施例中，液体流动封堵器可以位于每个连接上，或者可以位于每个分支上。在另一个实施例中，液体流动封堵器可以位于某些分支上，或者只在一个分支上。

液体流动封堵器可以包括尺寸做成能防止液体通过但允许气体通过的孔洞。流动封堵器可以用能帮助防止液体通过的材料制造。例如，如果液体是水基的，那么流动封堵器可以用排斥液体的疏水材料制造。

根据本发明的一个实施方式的公开装置的一个实施例的示意图如图2a所示。将液体和密封剂抽到装置100的共用流体通道106和孔104内的真空源160包括机动化驱动的带有活塞162的10毫升注射器(NE-1000，新纪元泵系统公司，美国)，以及用于打开/关闭由真空源160抽出的真空的两个夹阀(152和154)。液体沿箭头A的方向流动。200微升的艾本德(Eppendorf)管170被用作保持液体的容器。管170经硅胶管(未显示)连接到共用流体通道的入口。装置100的共用流体通道的出口经另一个硅胶管(未显示)连接到注射器160。

根据本发明另一个实施方式的公开装置的另一个实施例的示意图如图3所示。在该实施例中，装置100在流体通道106的第一端处将被流体连接到包含可能的目标分子的源170和密封剂源180。与源170的连接和与密封剂源180的连接汇合于流体通道106的第一端。与源170的连接包括可设定在“打开”位置142b和“闭合”位置142a之间的阀142，其中在"打开"位置，允许可能的目标分子从源170流入流体通道106的第一端并流过流体通道106；而在"闭合"位置，可能的目标分子的流动被阻断。与密封剂源180的连接包括可设定在“打开”位置144a和“闭合”位置144b之间的阀144，其中在"打开"位置，允许密封剂从源180流入流体通道106的第一端并流过流体通道106；而在"闭合"位置，密封剂的流动被阻断。

仍然参照图3，真空源160将被流体连接到4个分支，其中4个分支中有3个汇合于流体通道106的第二端。与真空源160的连接包括可设定在对应于4个分支的4个位置(146a，146b，146c，146d)之间的阀146。第一分支包括连接在流体通道106的第二端和真空源160之间的试剂流动封堵器158，并且处于阀位146a处。第二分支包括开口端连接，并且处于阀位146b。第三分支直接连接到流体通道106的第二端，并且处于阀位146c。第四分支包括连接在流体通道106的第二端和真空源160之间的密封剂流动封堵器156，并且处于阀位146d。下面会进一步详细解释装置100的该实施方式的操作。

在某些情况下，装置在填充过程中设置在竖直位置。

在某些实施例中，每个孔都可以包含检测探针。术语“检测探针”泛指能够与目标分子结合的分子，其中“检测探针”可能包括固定到支撑体上的探针分子或者未固定到支撑体上的探针分子。在一个实施例中，检测探针被固定到包括表面、薄膜或者颗粒的支撑体上。在另一个实施例中，检测探针不固定到支撑体上。

检测探针能够通过共价键、氢键、静电结合或者其他相互吸引结合到目标分子的至少一部分，例如目标核酸的特定序列，形成反应产物。反应产物可以发出能够被检测装置检测的信号，以检测目标分子的存在，或者在未形成反应产物的情况下，检测目标分子不存在。在一个实施例中，检测探针可以是结合到目标分子的蛋白质，目标分子也可以是蛋白质。因此，该实施例中的结合是经蛋白质-蛋白质相互作用来检测，例如，蛋白质结构中的构型变化。在另一个实施例中，检测探针可以是结合到目标分子的核酸，目标分子也可以是核酸。因此，该实施例中的结合是经过杂交来检测例如目标核酸存在与否或者核酸中存在单个核苷酸突变。

此处所指的液体可以是包括目标分子或者可能包括目标分子的源或者溶液。包括可能的目标源的源可以是从受验者上取下的生物样品，例如脸颊拭子，以检测特定基因存在与否。此处所用的术语“目标核酸”是指它所包含的序列区域可以结合到检测探针的互补区域上的核酸序列。目标核酸序列可以扩增，并且当与检测探针的互补区域杂交时，它有可能检测是否存在目标核酸以及目标核酸的定量。在该申请中所用的术语“杂交”是指两个完全或者部分互补的单个核酸链能够沿反向平行方向聚合，从而形成具有双链区域的稳定结构。这一双链结构(有时称为杂交种)的两个组成链用氢键保持在一起。尽管这些氢键通常形成在单个核酸链上包含碱基腺嘌呤和胸腺嘧啶或者尿嘧啶(A和T或者U)或者胞嘧啶和鸟嘌呤(C和G)的核苷酸之间，但是碱基配对可以形成在不是这些“规范”对的成分的碱基之间。非规范碱基配对在本领域是公知的，例如，参见《核酸生物化学》(亚当等，eds.，1992)。

检测探针可以结合到用于测量目标与检测探针的杂交的检测装置，诸如标记物。标记物可以是放射性同位素或者荧光基团。在一个实施例中，每个检测探针可以与不同的荧光基团配对，因此可以辨别不同的探针。

例如，检测探针包括DNA或者RNA。在其他实施例中，检测探针包括具有发夹回路结构的单链多核苷酸，它能够与样品多核苷酸的一个区域形成双链络合物。在一个实施例中，检测探针可以是包含荧光基团和猝灭剂的引物或者分子信标(MB)探针。在一个实施例中，在使用之前，MB探针不需要任何进一步的改进。在另一个实施例中，检测化验不需要额外的一价或者二价盐或者添加剂，诸如牛血清白蛋白(BSA)。在没有目标分子的情况下，MB探针保持在稳定的发夹结构中，以便来自荧光基团的荧光因荧光基团接近多核苷酸的一端而猝灭剂在多核苷酸的另一端而被完全猝灭。例如，MB探针的5’端的羧基荧光素(Fam)荧光基团或者Rox荧光基团接近3’端处的Dabsyl会猝灭任何荧光。如果存在目标分子，探针的一部分与目标分子的互补序列杂交，导致荧光基团和猝灭剂分开，随后导致荧光基团发出荧光。

可以使用荧光染料的其他实施例，包括SYBR Green I、Eva Green和LG Green。

在某些实施例中，目标分子包括DNA或者RNA。在某些实施例中，目标分子包括所关心的基因。在一个实施例中，所关心的基因可以是赋予对抗抗病毒或者抗菌处理(例如用一种或多种抗生素处理)的抵抗力的基因。在另一个实施例中，所关心的基因可以是细菌和病毒的基因。在一个特殊的实施例中，所关心的基因与人副流感病毒(HPIV)有关，例如HPIV1和HPIV2。在另一个实施例中，所关心的基因可以是埃氏大肠杆菌质粒(E.coli plasmid)DNA。

在一个实施例中，检测探针和目标分子之间的反应在室温下(例如30℃)基本是瞬时的。所关心的目标可以与各个检测探针杂交，发出的信号在30℃的最适温度下以小噪声获得。在另一个实施例中，探针和目标不需要任何培育就能产生反应产物。可能的反应之前或之后也不需要任何洗涤。

该装置可以包括覆盖材料，以封闭多个孔或者通道。封闭多个孔或者通道的材料可以是透明的。在一个实施例中，多个孔或者通道被薄透明带覆盖，例如来自美国加利福尼亚应用生物系统公司的MicroAmp^TM光学粘膜，该光学粘膜与PCR兼容，且不含DNA/RNA/核糖核酸酶。装置的剩余部分可以用半透明材料或者不透明材料制成。

该装置可以用不阻碍检测探针与目标分子结合的材料制成。材料可以是聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯、聚乙烯醇、丙烯腈丁二烯苯乙烯或者聚苯乙烯。在一个实施例中，该装置可以与市场上发现的共用PCR试剂兼容，例如来自荷兰Qiagen公司的PCR主混合物(Taq PCR Master Mix试剂盒)，美国威斯康星州的Promega(GoTaq Hot Start Colorless Master Mix)和美国加州的Invitrogen(Platinum PCR SuperMix)。

此处公开的微流体装置可以包含在下面将要详细描述的系统中。

在一个实施方式中，提供了一个系统，包括：此处公开的微流体装置，布置在微流体装置上方或下方的检测装置，用于在使用过程中检测由包含在孔中的可能的反应产物发射的信号。

检测装置可以是光学系统。光学系统可以包括光源和滤光器，滤光器能够捕捉由检测探针和目标分子的反应产物发出的信号。光源和微流体装置的多个孔可以同心设置。在一个实例中，每个孔可以接受相同强度的光，由此对可能的反应产物进行基本上一致的探测。光源可以是紫外线-可见光(UV-Vi)宽谱带汞/LED光源，滤光器可以是激励、发射和分色滤光器，每个滤光器具有对准所用荧光染料的兼容波段。光源能够照亮微流体装置的多个孔，以便相机可以捕捉发出的可能信号的影像。包含在检测装置中的光源和滤光器还可以由透镜和摄像机发出信号，以激发反应产物产生荧光。合适的摄像机的实施例是从加拿大QImaging公司得到的Retiga EXi CCD摄像机或者从加拿大不列颠哥伦比亚省列治文市的灰点研究公司获得的基于Grasshopper2CCD的红绿蓝(RGB)摄像机，带有从美国新泽西州埃德蒙光学系统公司获得的25毫米焦距的透镜。摄像机捕捉的影像可以用处理程序处理。例如，可以使用美国马萨诸塞州Mathworks公司的Matlab图像获取工具箱中的定制图像分析软件。处理程序可以由处理器(例如计算机)管理。在一个实施例中，光学系统为发出信号(例如荧光)的一次成像提供非机械化装备。

光电二极管和CCD摄像机都可以用来检测PCR的荧光信号。由于光电二极管是点测器，因此为了同时监视更多的PCR孔，必须使用光缆和光学多路复用器。由于处理能力进一步增加，因此这会变得日益复杂且昂贵。另一方面，CCD摄像机检测的是一个区域而非一个点的信号，因此被监视的PCR孔的数目没关系。但是，由于光源和PCR孔之间以及PCR孔和摄像机之间需要一定的距离，因此基于摄像机的检测的灵敏度一般小于基于光缆的检测，后者随距离增加会有小的传输损耗。但是，对于PCR产物检测来说，灵敏度的降低一般不是问题。随着更灵敏且成本更经济的CCD摄像机的可利用性的增加，越来越多的商用实时PCR系统可以使用CCD摄像机作检测器。

公开的系统还可以包括与多个孔热连通的发热元件。

加热模块可以是帕尔贴热电装置。热电装置可以包括风扇、热电(TE)加热器/冷却器、以及热电控制工具包。热电控制工具包可以包括扩增器和温度控制器。热电加热器可以由扩增器供能，扩增器由温度控制器控制。T型热电偶可以安装在热电加热器上以测量温度，并且可以用作温度控制器的反馈。热电加热器和孔内实际温度之间的温差可以通过用等体积的PCR产物直接测量孔内温度来校准。铝冷却热沉可以连接到热电装置。

该系统还可以包括连接到流体通道第一端的流体源，例如，包含可能的目标分子的源、密封剂源，洗涤剂源、用于反应的试剂的其他源、正压源、或者其组合。

系统还可以包括连接到流体通道第二端的真空源。

一个或多个阀可以连接在流体通道和密封剂源、包含可能的目标分子的源和真空源之间。

各种可能的连接如上所述。

真空源可以是真空泵或者注射器。正压源可以是正压泵或者注射器。

真空源可以设置成考虑到微流体装置、共用流体通道、隔离通道和/或孔的大小视情况而定提供合适容积的真空。可以选择真空容积，以获得如下所述的填充步骤(i)的合适速度。在一个实施例中，对于约3微升的单孔容积而言，真空源可以配置成为填充步骤(i)提供约1到22毫升之间、或者约2到22毫升之间、或者约3到22毫升之间、或者约4到22毫升之间、或者约5到22毫升之间、或者约1到20毫升之间、或者约1到15毫升之间、或者约5到15毫升之间的真空容积。可选地，可以为填充步骤(i)拉出约-50千帕到约-100千帕的真空。如果步骤(i)中施加的真空容积过高，微流体装置内可能形成气泡，从而降低可用于反应的样品的体积。气泡也可以改变反应结果。此外，在高填充速度下，可能产生紊流，导致气泡被圈闭在液体内。如果步骤(i)中施加的真空过低，用于填充所有孔的时间可能太长，这也不方便。一些孔也可能不能完全充满。

在一个实施例中，公开的装置和系统可以配置成提供高达8毫秒/孔的液体填充速率，同时防止现有技术中面对的缺点。公开的装置和系统可以提供更快的进行反应的方法。

真空源可以配置成为如下所述的填充步骤(ii)提供约10到100微升/分钟或者约30到70微升/分钟的真空流速。应该指出的是真空源可以配置成提供落在该范围内的任何其他真空流速。

根据本发明的一个实施方式的公开系统的一个实施例的示意图如图4a所示。在该实施例中，系统200包括接触加热元件202的PCR装置100。加热元件202包括热沉204和风扇206。系统200还包括光学系统210。光学系统210包括光源212。来自光源212的光经光纤214传递，并且由激励滤光器216过滤，以产生激励光束。该光束由镜子218反射，以横向激发垂直位于其下方的PCR装置100。由PCR芯片100中的样品沿着箭头B发出的光由发射滤光器219过滤，产生荧光信号。该信号被具有固定焦距的紧凑透镜(未显示)聚焦。聚焦的光随后被冷却的CCD摄像机220检测，并且通过分析在某些时间点被摄像机捕捉到的图像来获得整个芯片100上的光强度。

在某些例子中，公开的系统不仅能够单独使用，而能够作为集成系统的一部分。典型的集成系统公开在美国专利No.8343443B2中。

图13提供了集成的多合一分子诊断装置500的分解图，该装置包括PCR芯片102和样品制备盒502。样品制备盒502用原样品504(例如血液和鼻拭子)制备目标分子，例如DNA/RNA或者蛋白质。样品制备盒502还包括用于密封剂180的通道以及用于废品508和洗涤剂510的通道。样品制备盒502和PCR芯片102被装配到集成盒500内。一装好，包含目标分子的洗脱溶液506就被传输到Ω形芯片102，并且引入已经预装有分子探针的单孔104。根据用途，可能需要加热器来加热芯片孔中的PCR混合物。可能需要检测装置，例如CCD摄像机或者光电探测器，来测量从孔中发出的光信号。

下面详细描述公开的装置和系统的使用方法。

在一个实施方式中，提供了一种使用此处公开的系统从液体样品中检测至少一种目标分子的方法，其中该方法依次包括：(i)用来自包含有目标分子的源的液体样品填充多个孔；(ii)用来自密封剂源的密封剂填充共用流体通道；(iii)允许检测探针和目标分子之间在多个孔中进行反应；(iv)检测由反应产物发出的信号。

步骤(i)可以包括当流体通道脱离包含可能的目标分子的源时，从真空源抽真空持续预定时间段；当连接或者断开真空源时，将包含可能的目标分子的源连接到流体通道的第一端。在某些例子中，可以除去可能存在于微流体装置内的空气，例如在多个孔、隔离通道和/或共用流体通道中。例如，在除气之后断开真空源的实施例中，来自包含可能的目标分子的源的液体样品仍可以因保持在微流体装置之内的真空而填充多个孔。在除气之后连接真空源的实施例中，步骤(i)的速度可以进一步增加。试剂流动封堵器可以设置在真空源之前，以防止液体样品接触真空源。

另外，步骤(i)可以包括当流体通道的第一端连接到包含可能的目标分子的源时，从真空源抽真空。例如，可以除去可能存在于微流体装置内的空气，例如在多个孔、隔离通道和/或共用流体通道中的，同时，来自包含可能的目标分子的源的液体样品可以因抽出的真空而填充多个孔。试剂流动封堵器可以设置在真空源之前，以防止液体样品接触真空源。

在步骤(i)中，多个孔可以依次被填充。孔的填充容积可能对抽真空的强度不敏感。因此，公开的方法的步骤(i)也许能产生前后一致的结果。此外，步骤(i)可以基本等量地填充多个孔。

在步骤(i)之后、步骤(ii)之前，公开的方法还可以包括，将包含可能的目标分子的源与流体通道断开的步骤；以及从真空源抽真空持续预定时间段，以除去流体通道中过量的液体样品。在一个实施例中，可以从流体通道中除去过量的液体样品，以便可能的反应产物的检测只能在孔中进行。在另一个实施例中，可以防止结果错误的检测。

步骤(ii)可以包括当流体通道脱离密封剂源时，从真空源抽真空持续预定时间段；当连接或者断开真空源时，将密封剂源连接到流体通道的第一端。例如，可以除去可能保持在共用流体通道之内的液体样品。例如，在样品除去之后断开真空源的实施例中，来自密封剂源的密封剂仍有可能因保持在微流体装置之内的真空而填充共用流体通道。在样品除去之后连接真空源的实施例中，步骤(ii)的速度可以进一步增加。密封剂流动封堵器可以设置在真空源之前，以防止密封剂接触真空源。在一个实施例中，密封剂防止样品在反应过程中因温度而蒸发。此外，密封剂隔离每个孔中的样品，从而防止相邻孔之间交叉污染。

密封剂可以是任何类型的可以至少部分阻断或者防止孔中的液体泄漏以有效隔离孔中的液体的物质。所说的“隔离”，意指特殊的物种或者物质与混合物、样品或者生物标本分开。例如，孔中的液体在隔离之后可以不失散到环境中，例如通过蒸发。例如，在隔离以后，包含在每个孔中的液体不会污染其他孔中的液体。还可以减少导致假阳性发射读数的杂散信号发射出现。在一个实施例中，没有出现假阳性或者假阴性。所说的“有效”，意指孔中的液体(包括隔离通道中的液体)与孔外的混合物、样品或者样本(例如共用流体通道中的)充分分离。密封剂可以是具有比孔中液体更低的汽化速度的任何类型的材料。密封剂可以是沸点高于孔中液体的任何类型的材料，以便在使用方法的最高工作温度下保持为稳定的液体，并防止水蒸汽的传输。密封剂可以是不与孔中液体混溶的任何类型的材料。密封剂可以是不允许孔中液体的蒸气通过的任何类型的材料。密封剂可以是硅油、蜡、聚合物、明胶、树胶、淀粉、或者它们的衍生物。

在一个实施例中，密封剂可以是液体蜡。此处使用的术语“蜡”包括诸如棕榈蜡、坎台里蜡、蜂蜡、等之类的天然存在的脂肪酸酯，矿物油，以及诸如聚乙烯、石蜡、地蜡、等具有蜡的物理性能的其他有机材料。固体石蜡一般被用于定义通常从来源于混合基或者石蜡基类型的矿物油的石油馏分中获得的硬结晶蜡，并且可以包括诸如高沸点馏分蜡和微晶蜡之类的材料。

可选地，步骤(ii)可以包括当流体通道的第一端连接到密封剂源时，从真空源抽真空。例如，可以除去可能存在于共用流体通道中的样品，同时来自密封剂源的密封剂仍有可能因抽得的真空而填充共用流体通道。密封剂流动封堵器可以设置在真空源之前，以防止密封剂接触真空源。

为增加填充步骤(i)和/或(ii)的速度，密封剂可以从密封剂源泵送到流体通道的第一端，并且/或者可能的目标分子可以从其来源被泵送到流体通道的第一端。正压可以从包含可能的目标分子的注射器中产生，因此活塞被向内推，以将可能的目标分子泵送到流体通道的第一端。正压可以从包含密封剂的注射器中产生，因此活塞被向内推，以将密封剂泵送到流体通道的第一端。

在步骤(i)中产生的真空的真空容积可以如此处公开的那样。例如，步骤(i)中产生的真空的真空容积可能在约5到22毫升之间。

可以按此处公开的速度除去流体通道中过量的液体样品。例如，可以按30到70微升/分钟的速度除去流体通道中过量的液体样品。

在一个实施例中，下面将参照图3描述图3的根据本发明的实施方式的系统的操作方法。

步骤1:阀142被定位在142b处，而阀146被定位在146a处。泵160如图所示处于其零容积位置。当活塞162开始沿着箭头的方向向外移动时，原来包含在流体通道106、隔离通道108和孔104中的空气被吸出，并且经过试剂封堵器158被输送到泵160。试剂封堵器158和密封剂封堵器156用带有小孔洞的高疏水性薄膜制造，以阻止液体传送，但允许气体通过。

步骤2:阀142被切换到位置142a。现在，试剂被步骤1产生的真空从试剂容器170抽到流体通道106和各个孔104内。一旦所有孔充满试剂，额外的试剂到达试剂封堵器158并停在那里。来自压力检测器170的信号表明填充过程结束，并且阻止泵工作。

步骤3:阀146被切换到位置146b，以释放泵中的真空。

步骤4:阀144被定位在144b处，而阀146被切换到位置146c。现在泵160从其零容积位置慢慢向外移动，并且保持在流体通道106中的试剂被缓缓除去。

步骤5:阀144被切换到位置144a，而阀146被切换到位置146d。密封剂通过流体通道106，以密封所有孔104。一旦密封剂到达密封剂封堵器156，它停在那里，密封过程结束。

在一个备选实施方式中，正压也可以代替抽真空，被用作芯片填充和密封的驱动力。为此，不需要在步骤1中产生真空。在此情况下，施加于试剂容器上的压力会推着试剂流进流体通道，然后是隔离通道，并流进孔中。可能需要在孔中形成额外的出口，以允许原来存在于孔中的空气逸出。例如，上覆盖带可以钻上小洞，每个小洞对应一个孔。可选地，下覆盖带可以用带有小孔隙(pores)的气体渗透膜代替。在这两种情况下，空气可以离开小洞或者孔隙，但强表面张力有助于防止液体泄漏。在孔被填充之后，可以执行步骤4和步骤5，以密封和隔离反应孔。然后密封在孔中的试剂准备进一步反应，例如PCR扩增和检测。

可以用公开的装置、系统和方法进行聚合酶链反应(PCR)。在一个实施例中，可以用公开的装置、系统和方法进行聚合酶链反应，涉及的温度小于95℃、小于90℃、小于85℃、或者小于80℃。根据用途，气泡可以在80℃或者更高的反应温度下形成在孔中。在一个实施例中，可以用公开的装置、系统和方法进行等温聚合酶链反应。如名字暗示的那样，等温聚合酶链反应在单一温度下进行，并且不需要常规聚合酶链反应方法中所需的热循环。由于不涉及任何热循环过程，因此等温聚合酶链反应系统，例如此处公开的装置和系统，允许简化的设计和低得多的能量消耗。约有8种等温聚合酶链反应方法，包括最常用的基于核酸序列的扩增(NASBA)、环介导等温扩增(LAMP)、依赖解旋酶扩增(HDA)、滚环扩增(RCA)和链置换扩增(SDA)。在另一个实施例中，可以用公开的装置、系统和方法进行不对称聚合酶链反应。在又一个实施例中，可以用公开的装置、系统和方法进行诸如酶联免疫吸附试验之类的抗体化验、或者分子诊断用途。

等温聚合酶链反应扩增方法的一个实施例是NASBA，它是连续方法。它在41℃的相对低温下工作，这使得它非常适合与低功耗手持装置一起使用，诸如公开的微流体装置。NASBA扩增方法模拟逆转录RNA复制，而不需要热循环。在扩增过程中，NASBA使用三种酶：逆转录酶、R Nase H和T7DNA依赖型RNA聚合酶。在一个实施例中，NASBA具有高扩增系数。例如，反应可以用两个对目标RNA有特效的引物在1.5小时内产生大约十亿个互补的RNA分子。可以用分子信标实现实时NASBA。

等温聚合酶链反应扩增方法的另一个实施例是依赖解旋酶扩增(HDA)，它基于DNA复制叉的自然机制。HDA方法可以在65℃的唯一温度下工作。HDA也可以具有高扩增系数。例如，IsoAmp tHDA试剂盒(新英格兰生物实验室(美国比弗利))可以扩增70到130bp的短DNA序列。已经在短至85bp以及长至129bp的产物上实现了成功的tHDA扩增。

因此，在一个实施例中，目标分子是扩增反应的反应产物。扩增反应由依赖模板的方法使得核酸分子的浓度相对于其初始浓度增加。术语“模板依赖方法”是指涉及引物分子的模板依赖型延长部分的方法。扩增方法包括但不局限于聚合酶链反应(PCR)、DNA连接酶链反应和所属领域技术人员熟知的其他扩增反应。扩增反应的成分包括用于扩增目标核酸的试剂，例如扩增引物、多核苷酸模板、脱氧核糖核苷酸三磷酸盐、聚合酶和核苷酸。在一个特殊的实施例中，目标分子是等温聚合酶链反应的反应产物。

公开的装置和系统可以提供多个孔，用于检测多个目标。在某些实施方式中，布置成圆形的孔便于光强度从点光源均匀分配于所有孔。通过施加真空于装置和系统上作为液体流的驱动力，公开的方法可以为孔快速填充液体。在一个实施例中，单个孔可以在8毫秒内填满，并且不同孔可以获得均匀的填充容积。装置和系统的操作已经在包括来自HPIV病毒的RNA样品的NASBA等温聚合酶链反应和来自埃氏大肠杆菌的目标DNA的HDA等温聚合酶链反应的过程中成功得以证明。

此处说明性地描述的发明可能适合在没有此处未特别说明的任何元件、限制的情况下实施。因此，例如，术语"包含"、"包括"、"含有"、等等应该扩大且不受限制地理解。另外，此处使用的术语和表达已经用作描述的术语而非限制，在使用这些术语和表达时无意排除所示的和所描述的特征或其某些部分的任何等价物，但认为在要求保护的发明的范围内可以进行各种改进。因此，应该理解虽然本发明已经由优选实施方式和优选特征特别公开，但此处公开所体现的发明的任何改进和变形都可以诉诸于本领域技术人员，并且这些改进和变形被认为落在本发明的范围内。

本发明已经在此被广泛而一般地描述。落在普通公开内的每个较窄的形式和亚属分组也形成本发明的一部分。这包括发明的带有从该类中除去任何主题的限制条款或者否定限制的一般描述，不考虑删除的材料在此是否被特别列举。

其他实施方式在以下权利要求和非限定性实施例的范围内。另外，如果本发明的某些特征或者某些方面用马库什组来描述，本领域熟练技术人员会认为本发明也是用马库什组的任意单个成分或者各成分的子组来描述的。

实验部分

实施例1：芯片制备

芯片设计是用CAD软件Solidworks^TM(Dassault Systèmes SolidWorks公司，法国)生成的。然后用计算机数控(CNC)机器(WHITS技术，新加坡)制造带孔的聚碳酸酯基片。制造的PC基片随后被浸入0.2％的清洁剂(Decon 90，Decon实验室有限公司，英国)溶液中12小时，随后用去离子水彻底漂洗，以便从CNC机械加工程序中除去任何油污。接下来，芯片被浸入3％H₂O₂(MGC纯化学品，新加坡)中12小时，用0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)(Sigma-Aldrich，新加坡)漂洗，以除去RNA酶和DNA酶，然后在60℃下烘干6小时。吸量管尖端(体积：20微升)被切成7毫米长的段，以用作入口管和出口管，并且被粘到流体通道两端处的两个孔洞上。光学粘膜(MicroAmp^TM，应用生物系统公司，马萨诸塞州，美国)被用40瓦的CO₂切割系统(Helix 40，Epilog公司，美国)在20％的激光功率下激光切断成所需规格，然后被施加到聚碳酸酯基片的顶面和底面。

实施例2

来自实施例1的芯片被用在这个实施例中。芯片的示意图被显示在图2a中，在这个实施例中参考图2a。芯片的操作如下。

步骤1。真空注射器160被调整到零容积。入口夹阀152被关闭，同时出口阀154被打开。真空注射器160的活塞162向外移动，产生真空，以从芯片100的通道和孔中除去空气。注射器的目标容积被调整到2.5、5、10或者15毫升，这取决于随后的孔填充步骤所需的真空度。如图2b所示，对应于注射泵的真空容积的孔中的实际压力被校准。

步骤2。阀152被打开。由于共用流体通道和孔在步骤1中产生真空，因此PCR混合物在0.5秒内移动到芯片100的流体通道内并且按照顺序一个接一个地填充各孔。一旦PCR混合物到达芯片100的出口，阀154被关闭，以使芯片100与注射泵160中的真空隔离。由于真空保持在共用流体通道和孔中，因此填充过程继续。约10秒之后，当所有孔被完全填充时，阀152也被闭合。

步骤3。具有PCR混合物的艾本德管170被移走。同时，注射泵160中的真空被释放。然后阀152和154被打开。注射泵160被启动，并且以50微升/分钟的低速运行。结果，保持在共用流体通道内的PCR混合物被缓缓地抽出芯片100。然后，另一个包含100微升液体蜡(Bio-Rad，新加坡)的艾本德管(未显示)被连接到芯片100的入口。随着从注射器160泵出，硅油逐渐充满流体通道，而其不溶于水的性质有助于有效地密封芯片100中所有的单独的孔。

为了研究PCR混合物填充/密封过程的细节，用高速摄像机(MotionPro X4，DEL成像系统，美国)以600帧/秒的记录速率监视上述过程。用去离子水模拟PCR混合物溶液，外加墨水以改善图像对比度，以易于观测。当获得相应帧时，可以从该时间点处获得瞬时信息。

接着上述步骤调查PCR芯片的填充/密封过程。

芯片的出口被连接到一个10毫升注射器上，该注射器通过电动注射泵控制。注射器的活塞被向内推到零容积。在开始样品加载以前，入口和出口夹阀被分别调整到“闭合”和“打开”位置。当活塞开始向外移动时，原来密封在芯片通道和孔中的空气(环境压力＝P₀，容积＝V₀)膨胀。当空气体积增加到V时，可以根据理想气体定律计算通道/孔内的压力P：

P＝P₀V₀/(V₀+V)

在这个实施例中，注射器的真空容积V被调整到1-10毫升，这产生-79.9到-89.9千帕的真空。在入口夹阀被打开之前，真空被保持10秒压力稳定。在入口阀打开之后，容器中承受压差(P₀–P)的PCR混合物沿着流体通道移动，并且进入每一个反应孔。图5a显示了从用高速摄像机拍摄的影像中得到的样品加载快照。可以看到流体通道和反应孔内的空气被外部注射器吸出，然后PCR混合物被引入，以填充流体通道和反应孔。孔被顺序填充-入口附近的孔比出口附近的孔被先填充。对于35孔的PCR芯片，填充过程在300毫秒内完成10毫升的真空容积。

每个孔的平均填充容积对所施真空的相关性如图5b所示。每个孔中液体的体积通过用精密重量天平(AB204-S，Mettler Toledo，美国)测得的重量除以液体密度来计算。发现填充容积对于为本申请而最优化的真空容积的范围(5-15毫升)不敏感。例如，与5、10和15毫升的真空容积对应的填充容积分别为3.02、3.11和3.06微升。这些值非常接近根据孔尺寸(直径＝2.0毫米，深度＝1.0毫米)计算得到的3.14微升的完全充满的孔中的理论液体容积，表明在样品加载过程中孔被完全或者几乎完全充满。

图5c显示了沿着流体通道填充在不同孔中的容积。第一孔具有3.09微升的稍高的填充容积，而最后的孔具有2.99微升的填充容积。它们在填充容积上的差别为3.3％，表明在不同孔的填充上具有优良的均匀性。对于流动通道沿线的孔，填充容积仅有非常轻微的下降。这种较小的差别可能起因于填充过程中逐渐下降的真空度，即在稍微低点的真空水平下，下游孔可能填充得稍微少一点。

由于真空可以被轻易地施加到微流体系统上，因此该实施例表明公开的PCR混合物填充方法预计比现有技术的方法更有效，这已经通过下面的实验得到确定。

实施例3a：所施真空度的优化

实施例2中公开的PCR混合物填充方法的有效性在这个实施例中被证实。

对真空填充重要的一个参数是所施加的用于驱动流体的真空度。真空不足会使填充过程减速。这会进一步导致相当多的空气被圈闭在反应孔中，这可能会因圈闭空气在高温下膨胀而造成PCR过程出现故障，引起扩增和检测上的问题。另一方面，如果真空度是过高，可能会因水在低压下蒸发而形成气泡，这会因阻断流体和隔离通道而负面影响填充过程。

为了获得最佳真空度，测试了1-22毫升的真空容积用于样品加载，并且研究和比较了相应的填充质量。

图6a显示了当使用的真空容积不足、小于5毫升时PCR室的照片。如图6a所示，几个PCR室没有完全充满，如箭头所示。

另一方面，图6b显示了当使用22毫升的真空容积时PCR室的照片，证明气泡容易形成在流体通道和孔内(如箭头所示)。在此情况下，一些PCR混合物溶液可能会蒸发，并且PCR混合物溶液可能会损失。此外，高填充速度也会产生紊流，因而空气会被圈闭在填充液体内成为气泡。因此，表明在这个实施例中合适的真空容积在5-15毫升的范围内。

实施例3b：反应孔的密封优化

为了密封和隔离每个PCR孔，研究了液体蜡。图7显示了该实施例中的密封程序的进程的照片。

参照图2a，在PCR混合物被装入孔104之后，出口夹阀154被关闭，注射泵160中的真空被释放到大气中。接下来，夹阀154被再次打开，注射泵160以50微升/分钟的流速慢慢泵出保持在流体通道106内的PCR混合物。

图7a到7c显示PCR混合物的移除进程。在PCR混合物被完全除去之后，液体蜡从入口被引入，并且填充流体通道中的空隙。白色箭头显示了流体通道中的PCR混合物和空气之间的界面。图7d到7f显示了液体蜡的引入进程。白色箭头显示了液体蜡在流体通道中的位置。PCR混合物被液体蜡密封在反应孔内，不会从奥米伽芯片中蒸发和逃逸。然后入口阀和出口阀都被关闭，然后整个芯片经受PCR热循环。

实施例4：实时PCR系统

在本实施例中构造和测试表征实施例1的PCR芯片的实时PCR系统。

示例性PCR系统如图4a所示。参照图4a，帕尔贴热电装置(TEC)202用于产生PCR反应要求的温度。铝冷热沉204被连接到TEC 202的后侧。此外，一个小冷却风扇206被连接到铝块上，以加强冷却效果。板的温度用2.252k-Ω的电阻式温度检测器(RTD)(Cat.#201347，FerroTec，美国)测量。FerroTec的数字温度控制器(FTC100)和H-桥式放大器(FTA600)被用于反馈温度控制。

开发了光学系统210，用于在实时PCR系统中检测SYBR Green I/Eva Green的荧光。来自固态可转换光源212(Lumencor，Spectra Light Engine，Lumencor公司，美国俄勒冈州比弗顿)的光通过光纤214(400微米，0.75m UV-SR，海洋光学)传递，并用激励滤光器216(D480/30X，色度技术公司，美国)过滤，以产生480纳米的蓝色激励光束。光束被镜子218反射，然后在垂直位于镜子下方10厘米处的检测PCR芯片100上被横向激发。从PCR芯片100中的样品发出的光被发射滤光器219(HQ535/50M，色度技术公司，美国)过滤，以在520纳米处产生荧光信号。该信号被具有固定焦距的紧凑透镜(Cat.59871，埃德蒙光学系统，美国)聚焦。透镜和PCR芯片100之间的工作距离介于15到25厘米之间。聚焦的光随后被冷却的CCD摄像机220(Retiga EXi，QImaging，加拿大)检测，通过分析在某些时间点被摄像机220获得的图像，获得整个芯片上的光强度。

用功率计(841-PE型，新港公司，加州，美国)测量与光轴的各个横向位移处的光强度(用μW/cm²表示)。数据(未显示)非常契合基于高斯正态分布的模拟结果(MATLAB，Mathworks公司，美国)(见图4b)。入射光的功率分布关于光轴轴对称，并且对于从-15毫米到15毫米的位移——这可与奥米伽芯片的尺寸相比，可以获得足够高的强度。假定奥米伽芯片和光强度的高斯分布都是径向对称的，结论是当芯片和光学检测同心设置时，每个孔都会接收相同强度的光。这是本光学检测系统的重要特征，它允许每个开孔获得相似的灵敏度。

实施例5：用于病毒检测的芯片内NASBA扩增

基于核酸序列的扩增(NASBA)被用于在实施例1的芯片上检测两种类型的人副流感病毒(HPIV)。

HPIV是儿科病人中上、下呼吸道疾病的主要原因，每年冬季都会爆发。有4种认定的HPIV血清型：HPIV1、HPIV2、HPIV3和HPIV4，但只有HPIV1和HPIV2常被发现。在这个实施例中，HPIV1和HPIV2被用于测试目的。

从NucliSens基础试剂盒(bioMérieux，英国)中选定NASBA所需的试剂。在进行实验之前，根据厂家推荐的规程制备它们。简单地说，80微升的试剂稀释液被添加到一个来自试剂盒的试剂球，以制造备用的试剂溶液。将试剂盒中14微升的KCl储备溶液与16微升的NASBA水混合，来制备备用的KCl溶液。将45微升来自试剂盒的酶稀释液添加到一个酶球中，制备酶溶液。HPIV1(Cat.VR-94D)和HPIV2(Cat.VR-92D)的RNA分子购买自美国典型菌种保藏中心(ATCC)(美国)。

由于每个孔具有3微升的容积，填充28孔的PCR芯片需要84微升的总样品容积。因此，制备120微升的PCR混合物来填充和测试，这包括30微升的病毒RNA模板、39微升的试剂溶液、15微升的KCl溶液、30微升的酶溶液和6微升的水。

引物和分子信标探针购买自Eurogentec(Cat.NB-PAI01-48用于使用Fam-Dabsyl分子信标的HPIV1检测，Cat.NB-PAI02-48用于使用Rox-Dabsyl分子信标的HPIV1检测)。在芯片组装过程中，引物被预沉淀到各个孔内。

NASBA化验涉及连续的等温过程，不需要热循环。在该实施例中用原始的病毒储备溶液以及10到10,000倍的稀释液来测试在芯片中进行NASBA化验的灵敏度。稀释的模板与其他组分混合，以制备120微升PCR混合物。为了制备阴性对照，无水的DNA酶和RNA酶被用于代替稀释的病毒样品。

用真空将PCR混合物引入奥米伽芯片的孔中，然后如上所述，用液体蜡密封。接下来，整个芯片被安装到TEC加热器上，然后在41℃下运行PCR扩增1.5小时。每5分钟用CCD摄像机获得芯片的影像。

图8显示了原料RNA样品及其10倍到10,000倍的稀释液(即在图8中的浓度为1.00E+01，1.00E+02，1.00E+03和1.00E+04)在奥米伽芯片上的实时检测中的扩增曲线。在反应约20分钟以后，除了阴性对照之外，荧光强度开始近似直线增加。对于阳性扩增，到阳性的时间从20分钟变化到30分钟。荧光强度的增加速度和输入模板RNA浓度之间有明确的关系。正如所料，较高的RNA浓度导致信号强度急剧增大。

图9显示了在奥米伽PCR阵列芯片上对HPIV1和HPIV2病毒进行同步端点检测的影像。具有25毫米焦点透镜的基于彩色Grasshopper2CCD的RGB摄像机(灰点研究公司，加拿大不列颠哥伦比亚省列治文)被用于该实施例。全象限带通滤波装置(Semrock公司，美国纽约州罗切斯特)被用作激励滤光器。如上所述，各孔被预加载Fam-Dabsyl或Rox-Dabsyl分子信标。前者对HPIV1的阳性识别显示蓝色，而后者对HPIV2显示红色。HPIV1和HPIV2样品的1:1体积比的混合物在该实施例中被用作RNA模板。

如图9所示，从沉淀有Fam-Dabsyl的孔中观测到深蓝色荧光，而从具有Rox-Dabsyl的孔中看到红色荧光。没有任何引物的孔(标记有叉号)不显示任何荧光信号，证实不同孔之间没有串扰。该研究证明奥米伽PCR阵列芯片可用于同步检测多个目标。

实施例6a：细菌培养和质粒DNA制备HDA

用于等温依赖解旋酶扩增(HDA)研究的埃氏大肠杆菌(ATCC25922)从ATCC(美国)获得。它们在胰蛋白酶大豆发酵液(TSB)缓冲液(BD，美国)中培养，缓冲液装在1.5毫升的艾本德管中，管放在41.5℃的热混合器(热混合器Comfort，艾本德公司，美国)上。在整夜培养之后，用离心机收集细菌。10微升连续稀释的细菌样品被引入C芯片(DHC-N01，Incyto公司，韩国)，然后用光学显微镜的CCD摄像机(IX51，奥林帕斯，美国)捕捉细菌的影像。细菌的数目从影像中清点，然后计算相应的密度。约103到109个细菌细胞被收集到1.5毫升的管中，用质粒Minit试剂盒(Cat.12143，Qiagen，新加坡)进行质粒DNA提取。

根据厂商的用户手册，提取包括三个主要步骤：(i)细菌细胞溶解和溶解产物收集，(ii)DNA提取和提纯，和(iii)DNA洗提。在细菌细胞溶解步骤中，细胞悬浮液在8000转/分钟下离心10分钟。在上清液被除去之后，250微升的缓冲液P1被添加到管中，以使细菌再次悬浮。接下来，添加250微升的缓冲液P2，并通过轻轻地翻转管子5次而彻底混合。在培育2分钟之后，添加350微升的缓冲液N3，并通过翻转管子10次而彻底混合。在细胞溶解步骤之后，溶液在10,000转/分钟下离心10分钟。收集上清液，并转移到QIAprep回旋柱进行DNA的提取和提纯。通过让溶液在3000转/分钟下回旋1分钟进行DNA提取。DNA分子被固相提取到回旋柱上，而流过的被丢弃。提纯过程涉及添加0.75毫升的缓冲液PE到柱上，然后在3,000转/分钟下离心1分钟。在洗提过程中，带有纯化DNA分子的柱子被放在清洁的1.5毫升管中。50微升的缓冲液PE被添加到管中。在培育1分钟之后，管在3000转/分钟下离心1分钟，然后收集洗提溶液中的纯质粒DNA分子，用于下游的等温HDAPCR扩增。

实施例6b：实时HDAPCR扩增

HDA基于DNA复制叉的自然机制。它可以在65℃的唯一温度下工作。

来自新英格兰生物实验室(美国比弗利)的IsoAmp tHDA-III试剂盒被用作在实施例6a中制备的埃氏大肠杆菌的质粒DNAs的等温PCR扩增检测。IsoAmp tHDA试剂盒可以放大70到130bp的短DNA序列。已经在短至85bp以及长至129bp的产物上实现了成功的tHDA扩增。

tHDA试剂盒包含PCR扩增所需的试剂，除了DNA模板、正向引物和反向引物。tHDA反应主要包括以下材料：1×退火缓冲液，25×酶混合物，14×dNTP溶液，3-4.5毫摩尔的MgSO4，和20-50毫摩尔的NaCl。在该实施例中，埃氏大肠杆菌DNA的目标M13基因被放大。根据引物1233和1224(新英格兰生物实验室，美国)的序列，正、反向引物分别为5’AGCGGATAACAATTTCACACAGGA3’和5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC3’。

IsoAmp tHDA试剂盒不提供实时PCR的报告染料。当前，SYBR Green I、Eva Green和LG Green是实时PCR最广泛使用的报告染料。虽然Eva Green和SYBR Green都可以使用，但先前的研究表明Eva Green具有比其他染料低得多的PCR抑制作用。因此，Eva Green被选作实时HDA的报告染料。

虽然反应孔的液体蜡密封有助于防止气体逃出芯片，但它不能消除高温下孔内的水分蒸发。为了解决这个问题，PCR混合物与一定量甘油预混合，以降低蒸气压。根据拉乌尔定律，水/甘油混合物的蒸气压P可以近似为：

P_(T)＝P_W(T)x_W+P_G(T)x_G

其中P_W(T)和P_G(T)分别是水和甘油在温度T下的蒸汽压，而x_W和x_G分别是水和甘油的摩尔分数。水和甘油的分子量分别是18和92；实验中使用的水和甘油的重量百分数可以用这些分子量转换为摩尔分数。由于在相同温度下甘油具有比水低得多的蒸气压，因此上述方程表明增加甘油可以降低PCR混合物的蒸气压。在沸点温度下，混合物的蒸气压等于1大气压的环境压力。对不同甘油浓度计算的沸点温度如图10所示。

已经研究过增加5％到20％(w/w)的甘油不会显著改变荧光强度和PCR的CT值。因此，在该实施例中添加15％(w/w)的甘油到PCR混合物。在该浓度下，混合物的沸点温度为约103℃。

细菌DNA目标区特定的正、反向引物对被预加载到各孔内。用真空将PCR混合物引入奥米伽芯片的孔中，然后如上所述，用液体蜡密封。

从约10³、10⁵、10⁷和10⁹个细菌细胞中提取的质粒DNA被引入4个不同的芯片，然后经受等温PCR扩增。每2分钟记录一次来自各个孔的荧光信号。结果显示在图11中。如图11所示，约27分钟之后，PCR扩增变得非常明显。对于不同细菌浓度的提取液，所需的时间没有显著差异，这表明HDA可能不适合埃氏大肠杆菌的定量检测。

荧光信号的一致性在基因的定量检测中很重要。为了核对奥米伽PCR中的检测一致性，预加载相同量的引物，并且真空填充相同的PCR混合物(包括从109个细菌细胞中提取的DNA样品)到每个孔中。在65℃下HDA40分钟之后，被捕捉的端点荧光信号被显示在图12a中。用ImageJ软件(NIH，美国)定量测量逐孔的信号强度，并且测量结果标绘如图12b所示。28个孔的信号强度读数从1208变到1533。28个孔的平均信号强度为1454，标准偏差为±93，这是平均信号强度的约6.3％，表明荧光信号完全均匀地分布在不同孔之间。