尿样中乙酰金刚烷胺的检测和定量的制作方法
【专利说明】尿样中乙酿金刚院胺的检测和定量 【背景技术】 技术领域
[0001] 本发明涉及生物标记的检测和定量，尤其涉及尿样中乙酰金刚烷胺的检测和定 量。
[0002] 相关抟术说明
[0003] 液相色谱质谱已被成功用于检测和定量生物样品，诸如尿中极其低含量的乙酰 金刚烷胺。如于2004年11月4日授权给Sitar等人的美国专利号6, 811，967中所公开 的，这可促进处于早期的癌症的诊断，因为对包括金刚烷胺的亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶 (SSAT)的乙酰化形式的定量可用于检测包括癌症的各种病理状态，其全部公开内容通过引 用并入本发明。然而，利用液相色谱质谱检测和定量乙酰金刚烷胺是相对耗时和高成本的。 因此，需要一种高效且成本节约的方法来检测和定量乙酰金刚烷胺，从而允许快速经济的 测试。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种改进的检测和定量尿样中乙酰金刚烷胺的方法。
[0005] 相应地，提供了一种定量尿样中乙酰金刚烷胺的方法。该方法包括使用固相萃取 从尿样中洗脱乙酰金刚烷胺，并使用拉曼光谱定量从尿样中洗脱的乙酰金刚烷胺。
[0006] 固相萃取可包括用甲醇洗脱乙酰金刚烷胺。使用拉曼光谱定量从尿样中洗脱的乙 酰金刚烷胺可包括基于底物的、表面增强拉曼光谱的使用。
[0007] 此处公开的方法基于尿样中乙酰金刚烷胺的定量，可用于对患者进行病理状态的 筛选。此处公开的方法基于尿样中乙酰金刚烷胺的定量，还可用于对患者进行癌症的筛选。
[0008] 此处公开的方法可用于在低成本下检测和定量乙酰金刚烷胺。 【附图说明】
[0009] 通过以下给出的【具体实施方式】的描述，仅以实施例的方式，并参照附图，本发明将 更容易理解，其中：
[0010] 图1显示了包被在表面增强拉曼散射（SERS)底物上的甲醇液滴中的乙酰金刚烷 胺露天蒸发和缓慢蒸发的结果；
[0011] 图2显示了使用SERS底物的乙酰金刚烷胺的定量；
[0012] 图3显示了甲醇中不同浓度的乙酰金刚烷胺的拉曼光谱；以及
[0013] 图4显示了基于图3中的拉曼光谱的校准曲线。 【具体实施方式】
[0014] 此处公开的是使用拉曼光谱来鉴定和定量尿样中的乙酰金刚烷胺，一种亚精胺/ 精胺N1乙酰转移酶（SSAT)代谢的产物。尿液是许多盐、极性代谢物和多种非极性类固醇 的浓缩溶液。在尿样中，预期的乙酰金刚烷胺的浓度比金刚烷胺的浓度小约1000倍。金刚 烷胺和乙酰金刚烷胺的区别是基于在大约1600cm 1波数处羧基的振动谱带。金刚烷胺和乙 酰金刚烷胺的光谱之间还有一些其他的差别，但是，这一个拉曼谱带是特别关注的，因为它 仅出现在乙酰金刚烷胺光谱中。
[0015] 制备尿样，并用固相萃取（SPE)分离尿样中的不同成分。相应地，尿样使用固相萃 取进行预处理，用以在使用拉曼光谱鉴定和定量存在于尿样中的乙酰金刚烷胺之前去除杂 质。
[0016]
[0017] 包括以下尿液成分 NaCl 8. 00g/L、KC1 1. 64g/L、K2S042. 63g/L、尿素 13. 40g/L 以 及肌酸酐1. 50g/L的人工尿液被用于制备具有皮质酮16. 7mM、金刚烷胺3. 3mM和乙酰金刚 烷胺3. 3uM的尿样。
[0018] 固相萃取（SPE)：
[0019] 尿样利用固相萃取进行处理以去除盐和极性杂质，提高乙酰金刚烷胺对金刚烷胺 的比例，并最小化来自非极性类固醇的污染。以下方案能实现上述三个目标，其使用菲罗门 公司（Phenomenex Inc.)的 Strata X、聚合物反相（Polymeric Reversed Phase)，菲罗门 公司（Phenomenex Inc.)位于加利福尼亚90501-1403,托伦斯，马德里大街411号。
[0020] (1)准备：2mL Me0H、2mL 去离子 H20、2mL 50mM pH 7. 0 的磷酸缓冲液。
[0021] (2)上样：将2mL的尿样和2mL的50mM pH 7. 0的磷酸缓冲液混合，并上样到SPE 柱上。
[0022] (3)洗涤1 :2mL去离子H20, 2x 1. 5mL 50mM pH 7. 0的磷酸缓冲液（盐和极性代谢 物和此部分一起洗脱）。
[0023] (4)洗涤2 :2x 2mL 40%溶于水中的甲醇（金刚烷胺和此部分一起洗脱，而乙酰金 刚烷胺和极性较小的类固醇皮质酮被保留）。
[0024] (5)洗涤3 :2mL 100%的甲醇（乙酰金刚烷胺和此部分一起洗脱，而皮质酮被保 留）。
[0025] (6)通穿过柱子的冲洗空气数分钟以使柱子干燥。
[0026] (7)洗脱液：2mL乙酸乙酯（皮质酮被洗脱）。
[0027] 在表而增强柃曼散射（SERS)底物h包被乙酰金刚烷胺:
[0028] 甲醇中的乙酰金刚烷胺，从上述SPE的洗涤3中获得，被滴加包被在SERS底物上 用于拉曼测量。在本实施例中，SERS底物是来自雷尼绍公司（Renishaw Inc.)的Klarite? SERS底物，雷尼绍公司（Renishaw Inc.)位于伊利诺斯州60192,霍夫曼伊斯塔特，垂林姆 大道（Trillium Boulevard)。乙酰金刚烧胺对SERS底物的均勾包被有助于可靠的定量。 观察到甲醇的缓慢蒸发能改进乙酰金刚烷胺对底物的包被。图1显示了露天蒸发和缓慢蒸 发的结果，其中缓慢蒸发中气流是受限制的。可以看出，缓慢蒸发产生了均匀的包被。
[0029] 柃曼测量
[0030] 在本实施例中，30uL甲醇中的乙酰金刚烷胺被滴加包被在SERS底物上，并允许缓 慢干燥。收集170个网格点的拉曼图，每个网格点处积分1秒钟。这170个光谱中，只有那 些显示出拉曼峰的被保留，其余的被忽略。图2显示了基于1600cm 1谱带的定量。达到了 要求的分辨率和Ing/mL的检测限，并且具有足够的信噪比。然而，本领域技术人员可知，可 以使用若干不同的峰来建立校准曲线，因为不同的峰会产生斜率稍有不同的校准曲线。
[0031] 伸用柃曼数据和分析律立柃准曲线
[0032] 图3显示了以下浓度的甲醇中的乙酰金刚烧胺的拉曼测量：lng/mL、5g/mL、10ng/ mL、25ng/mL和50ng/mL，这些浓度使用标准化学操作，将乙酰金刚烷胺溶解在甲醇中制 备。每个浓度选取拉曼光谱中的五个峰，也就是，738cm \776. 8cm\1198cm \ 1210cm1和 1436cm 、
[0033] 每个峰被分隔为峰面积和相邻面积。在每个峰面积和相邻面积选取10个点。这 些点被积分，且峰面积的数量总和减去相邻面积的数量总和被用于获得每个峰的强度。然 后可以通过对五个峰积分获得每个浓度下的拉曼强度，如下所示。
[0034]
[0035] 其中，I_k是峰面积中的强度，以及Iad_nt是相邻面积中的强度。之后，对每个浓 度的强度的和进行绘图，建立如图4所示的校准曲线，图4也显示了对分析的再验证。该校 准曲线可被用于在尿样中检测和定量乙酰金刚烷胺。
[0036] 结论
[0037] 结果表明乙酰金刚烷胺能使用固相萃取从尿样中分离。之后能用拉曼光谱来同时 检测和定量尿样中的乙酰金刚烷胺，并具有Ing/mL的灵敏度，从而对患者进行病理状态， 比如癌症的筛选。
[0038] 本领域技术人员可知，上述提供的许多细节仅仅是作为实施例，并无意限制本发 明的保护范围，本发明的保护范围是根据权利要求得出的。
【主权项】
1. 一种定量尿样中乙酰金刚烷胺的方法，所述方法包括： 使用固相萃取从尿样中洗脱乙酰金刚烷胺；以及 使用拉曼光谱定量从尿样中洗脱的乙酰金刚烷胺。2. 如权利要求1所述的方法，其中，所述固相萃取包括用甲醇洗脱乙酰金刚烷胺。3. 如权利要求1所述的方法，其中，使用拉曼光谱定量从尿样中洗脱的乙酰金刚烷胺， 包括基于底物的、表面增强拉曼光谱的使用。4. 如权利要求1所述的方法的应用，所述应用基于尿样中乙酰金刚烷胺的定量对患者 进行病理状态的筛选。5. 如权利要求1所述的方法的应用，所述应用基于尿样中乙酰金刚烷胺的定量对患者 进行癌症的筛选。
【专利摘要】一种定量尿样中乙酰金刚烷胺的方法，该方法包括使用固相萃取从尿样中洗脱乙酰金刚烷胺以及使用拉曼光谱定量从尿样中洗脱的乙酰金刚烷胺。
【IPC分类】G01N33/493, G01N1/40
【公开号】CN105209910
【申请号】CN201480027413
【发明人】鲁文·戈登, 布莱恩·郑, 纳斯德·卜克思, 布拉姆·拉姆贾汪, 阿夫塔卜·艾哈迈德, 弗雷泽·艾伦·霍夫
【申请人】百奥马克科技有限公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2014年3月14日
【公告号】CA2906236A1, EP2999964A1, US20160041145, WO2014139025A1