测试哺乳动物的状况具有 统计显著性的相关性的那些微生物类型作为指示所述受试哺乳动物的状况的生物标记，其 中所述状况选自：所述疾病的存在、所述疾病的严重性、对所述疾病的敏感性以及它们的组 合。
[0115] 所述取样部分可包括一种或多种器件，其形式选自勺、棉签、刀片、刷、探头、以及 它们的任何组合。在具体的实施例中，所述取样部分包括无菌棉签，通过用所述无菌棉签轻 轻擦涂暴露的牙齿表面实现取样。
[0116] 在具体的实施例中，本系统可包括样品储存部分用于储存样品。如果从所述取样 部分采集的样品不立即使用，推荐将其储存在样品储存部分中。在另外的具体的实施例中， 所述样品储存具有温度调节单元，其可向样品储存部分提供宽泛的储存温度范围，优选地 低于30°C，更优选地低于0°C。在一个优选的实施例中，所述样品储存部分提供的储存温度 低于-20°C，优选地低于-50°C，更优选地低于-70°C，并且最优选地低于-90°C。
[0117] 所述测量部分可以包括一个执行一种或多种方法的子部分，所述方法选自16S rRNA分析、遗传指纹分析、克隆文库方法、变性或温度梯度凝胶电泳、随机扩增多态性DNA、 DNA扩增指纹图谱、扩增核糖体核酸限制性分析、DNA芯片、荧光原位杂交、DNA-DNA杂交、 宏基因组学、宏蛋白组学、宏转录组学、蛋白基因组学、Luria-Bertani培养基分离技术、Nutrient Agar分离技术、Tryptic Soy Agar分离技术以及它们的任何组合。微生物群落 结构或功能数据可能随测量部分中实施的具体方法而变化。
[0118] 所述计算部分可为任何形式。例如，它可为个人计算机或包含计算程序的便携式 设备。根据具体的实施例，所述计算部分包括：
[0119] 1)与测量部分相联的输入模块，其中所述输入模块用于输入获得的第一微生物群 落、第二微生物群落和第三微生物群落中的一种或多种微生物类型的丰度；
[0120] 2)与输入模块相联的数据处理模块，其中所述数据处理模块被配置用于对跨该组 测试哺乳动物的第一微生物群落、第二微生物群落和第三微生物群落中的一种或多种微生 物类型的丰度进行统计学分析，以鉴定其丰度与所述状况具有统计显著性的相关性的那些 微生物类型；以及
[0121] 3)与数据处理模块相联的输出模块，其中所述输出模块用于显示那些经鉴定的、 作为指示所述受试哺乳动物的状况的生物标记的微生物类型。
[0122] 根据另外的具体的实施例，所述数据处理模块包含用于对输入的第一微生物群 落、第二微生物群落和第三微生物群落中的一种或多种微生物类型的丰度进行成对比较分 析或多变量分析的程序。
[0123] 根据另外的具体的实施例，所述数据处理模块包含用于对输入的第一微生物群 落、第二微生物群落和第三微生物群落中的一种或多种微生物类型的丰度进行成对比较分 析的程序，所述程序包含指令用于：
[0124] 1)将该组测试哺乳动物中的每一个哺乳动物的所述第一微生物群落和所述第二 微生物群落进行比较，以测定所输入的在所述第一微生物群落和所述第二微生物群落之间 每种微生物类型的丰度的变化；
[0125] 2)将所输入的来自步骤1)跨该组测试哺乳动物的每种微生物类型的丰度的变化 进行比较，以选择表现出统计意义上的显著性的丰度变化的那些微生物类型作为微生物类 型的初级组；
[0126] 3)将该组测试哺乳动物中的每一个哺乳动物的所述第二微生物群落和所述第三 微生物群落进行比较，以测定所输入的在所述第二微生物群落和所述第三微生物群落之间 每种微生物类型的丰度的变化；
[0127] 4)将所输入的来自步骤3)跨该组测试哺乳动物的每种微生物类型的丰度的变化 进行比较，以选择表现出统计意义上的显著性的丰度变化的那些微生物类型作为微生物类 型的次级组；以及
[0128] 5)将微生物类型的初级组和微生物类型的次级组进行比较，以鉴定出那些重叠的 微生物类型。
[0129] 根据另外的具体的实施例，所述数据处理模块包含用于对输入的第一微生物群 落、第二微生物群落和第三微生物群落中的一种或多种微生物类型的丰度进行多变量分析 的程序，所述程序包含指令用于：
[0130] 1)将所输入的所述第一微生物群落、第二微生物群落和第三微生物群落中的一种 或多种微生物类型的丰度正交转换，以导出占所输入的丰度中方差最大的向量；以及
[0131] 2)鉴定出具有表现出与导出的向量有统计意义上的显著的相关性的微生物群落 的那些微生物类型。
[0132] 根据另外的具体的实施例，所述数据处理模块包含用于对输入的第一微生物群 落、第二微生物群落和第三微生物群落中的一种或多种微生物类型的丰度进行多变量分析 的程序，所述程序包含指令用于：
[0133] 1)将所输入的所述第一微生物群落、第二微生物群落和第三微生物群落中的一种 或多种微生物类型的丰度正交转换，以导出占所输入的丰度中方差最大的向量；
[0134] 2)将所输入的该组测试哺乳动物中的每一个哺乳动物的第一微生物群落、第二微 生物群落和第三微生物群落中的每一种的一种或多种微生物类型的丰度投影至导出的变 量上，以获得针对该组测试哺乳动物中的每一个哺乳动物的第一微生物群落、第二微生物 群落和第三微生物群落的中的每一种的投影值；
[0135] 3)针对第一组测试哺乳动物的每一个计算跨第一微生物群落、第二微生物群落和 第三微生物群落的投影值的变化速率；
[0136] 4)基于所计算出的变化速率，将第一组测试哺乳动物分成测试哺乳动物的第一子 组和测试哺乳动物的第二子组，其中所述测试哺乳动物的第一子组与测试哺乳动物的第二 子组相比，表现出更大的变化速率；以及
[0137] 5)分别将测试哺乳动物的第一子组的第一微生物群落、第二微生物群落和第三微 生物群落与测试哺乳动物的第二子组的第一微生物群落、第二微生物群落和第三微生物群 落进行比较，以鉴定第一微生物群落、第二微生物群落和第三微生物群落中的每一种中丰 度在测试哺乳动物的第一子组和测试哺乳动物的第二子组间具有有统计意义上的显著差 异的那些微生物类型。
[0138] 在具体的实施例中，所述取样部分、测量部分和计算部分单独或以任何组合形式 可以实现为计算机程序产品，其包含在计算机可读介质中的计算机可执行指令。示例性计 算机可读介质包括芯片存储设备、磁盘存储设备、闪存装置、可编程逻辑器件、专用集成电 路、可下载电信号等等。此外，适用于本发明的计算机程序产品可定位于一个单一的设备或 计算平台，或可跨多个设备或计算平台分布。
[0139] 必要时，上述部分中的一者或多者可压缩成一个大型装置或小型便携式装置。
[0140]
[0141] 本文实例旨在例示本发明，却未必用于限制或换句话讲限定本发明的范畴。
[0142] 缩略语表:
[0143] NG:天然存在的齿龈炎
[0144]EG:实验性齿龈炎
[0145] MGI:改性的/Mazza齿龈指数
[0146] B0P:探诊后出血
[0147]MiGs:牙龈炎的微生物指数
[0148] RPM:减退-发展模型
[0149] PAM:围绕中心点的分割算法（聚类算法）
[0150] PCA:主成分分析
[0151] PCoA:主坐标分析
[0152] FDR:错误发现率
[0153] COG:同源群的聚类
[0154] MiG:齿龈炎的微生物指数
[0155] MiG:齿龈炎敏感性的微生物指数
[0156] R0C:受试者操作特性
[0157] CI:置信区间
[0158] K0:KEGG直系同源
[0159]RPM设计图1A示出了模拟人群中齿龈炎发展的纵向研究的设计。为了理解齿龈炎 的发病，建立了齿龈炎的实验模型来用作人的非侵入式模型。实验是经宝洁北京技术中心 (中国）机构审查委员会批准并根据赫尔辛基世界医学协会声明（1996修订），在宝洁（北 京）技术有限公司口腔护理部进行的。遵循针对优良临床试验规范（GCP)的ICH指南。从 北京区域募集了 91个受试者。提供了自愿知情同意书。
[0160] 包括了符合以下条件的个人：年满18岁；拥有至少12颗天然牙；在启动前访问中 (-21天）经Mazza牙龈指数测量（MGI)有至少5个出血点的；有齿龈炎但不是牙周炎；基 于对参与本研究的医学史/更新的审查由研究员/助理确定总体健康良好的。个人的排除 标准包括：严重的牙周病，表现为脓性分泌物，广泛的牙齿松动，和/或严重退化；任何针对 牙病预防治疗的给药需要抗生素术前用药的状况；在所述研究期间自我报告怀孕的或意图 怀孕的和哺乳中的女性；牙龈组织中典型的变色或色素沉着；面部固定矫治；牙龈组织中 典型的变色或色素沉着；在研究过程中的任何时候使用抗生素；可能会干扰受试者安全完 成所述研究的任何疾病或状况。在整个研究中每周测量每个受试者的临床参数。将在任何 时间点落入排除标准的个体从研究参与中排除。
[0161] 所述RPM包括三个阶段。
[0162] 阶段I，口腔卫生阶段（-21天至0天）：在-21天、-14天、-7天和0天采用Mazza 齿龈指数进行齿龈炎检查。接受牙病预防（龈上和龈下预防）和牙齿抛光后，指示每个受试 者每日两次回到这个地点，在这个时间，他们在监督下使用魅力亮洁型手动牙刷（佳洁士， 中国制造）、目前市售的没有任何明显的抗微生物活性的防蛀牙膏刷牙三分钟，然后用牙线 清洁牙齿的邻面面积。在接下来的21天遵循这个刷牙方案，同时对每个受试者每次访视记 录MGI。在口腔卫生阶段期间，如果受试者的出血点大于一处，受试者接受至多三次牙病预 防。
[0163] 阶段II，实验性齿龈炎阶段（0天至21天）：在这个阶段期间，受试者没有任何口 腔卫生操作，其包括刷牙、用任何产品漱口、牙线洁齿和牙病预防。在实验性齿龈炎阶段的 7天、14天和21天受试者也接受齿龈炎检查。
[0164] 阶段III，恢复阶段：指示每个受试者每日两次回到这个地点，在这个时间他们在 监督下使用阶段I的产品和技术刷牙。受试者在恢复阶段接受一次牙病预防，并且受试者 也接受齿龈炎检查，包括测量出血点，以记录和确认他们已经回到与他们进入该研究时同 等或优选的更好的健康。如果需要的话，受试者接受一次附加的预防，并监测直到被认为是 健康的。
[0165] 用探诊后出血（B0P)和Mazza齿龈指数（MGI)作为临床测量来评估齿龈炎。针对 每个受试者记录B0P频率和平均MGI。MGI同时测量了炎症的病症和严重出血的程度。具 体地，由牙医在每颗牙齿的近中颊[侧]和远中舌角进行探查，最多56个点。得分在0至 5的范围内，0为正常表现和健康的，齿龈炎最高为5分：自发出血（无缘无故情况下）。由 同一受过良好训练的牙医测量所有受试者的MGI以减少技术变量。
[0166] 图1B示出了在整个研究中50个受试者的上述临床参数的变化。在图1B中，方框 代表四分位差（IQR)，其中的直线代表中值。晶须代表1. 5xIQR内的最低值和最高值。在-21 天，所有受试者表现出一定程度的齿龈炎症，其代表天然存在的齿龈炎（"NG")，B0P在5至 27的范围内，并且平均MGI为1. 18至2. 24。然后这些受试者进行严格的口腔卫生操作三 周，其导致在0天（"基线")B0P和MGI大幅降低（B0P和MGI中值分别为1. 00和1. 02,代 表健康齿龈状态）。然后宿主另外进行针对诱导齿龈炎的口腔卫生计划三周，导致B0P(中 值23)和MGI (中值2. 11)大幅增加，其代表实验性齿龈炎（"EG"）的状态。
[0167] 龈上牙斑取样在-21天、0天和21天按照下述步骤从每个受试者采集龈上牙斑样 品。在取样前受试者不进行口腔卫生操作，其包括刷牙、牙线洁齿和漱口。在摄入食物或饮 料（水除外）后2小时采集样品。在MGI检查后，每个受试者用50ml无菌水漱口。在MGI 检查15分钟后，由有资质的牙医用格雷西刮匙（Gracey curette)采集沿齿銀线2mm厚的 牙斑。对于每个受试者，对所有牙齿在两对不同象限（1和3或2和4)采集牙斑样品并合 并至一管。通过用无菌棉签擦拭收集格雷西刮匙（Gracey curette)上的牙斑。将拭子端 部放入0. 6ml TE20缓冲液（20mM Tris-HCl PH 8. 0,2mM EDTA(乙二胺四乙酸））。在分离 DNA前，所有样品储存在-70 °C下。
[0168] 牙斑DNA提取规程按照稍作修改的Dr. Larry Fernery的规程从人齿牙斑提取总 DNA (Ravel J，等人（2011) Vaginal microbiome of reproductive-age women. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 :4680-4687)。一般来讲，在DNA分离实验前将冰冻的样品在冰上解 冻。将初始样品（250iil)转移至干净的Bead-Beating_Tube(2ml Eppendorf管）中。在 制备Lytic-Enzyme Cocktail(裂解酶混合物）时将样品悬液置于冰上。所有样品中加 入新鲜制备的 Lytic-Enzyme-Cocktail Master_Mix(100ul ;在 20mM 乙酸钠中包含 50 y 1 Lysozyme ~500KU = 10mg/ml，6 y 1 变溶菌素，25KU/ml，3 y 1 溶葡球菌酶，4000U/ml 和 41yl TE缓冲液）在37°C下温育45分钟。向溶胞产物混合物中加入750mg干净的和干燥 的 0? 1mm直径的 Zirconia-Silica-Bead。在室温下、样品在 Qiagen TissueLyser LT(36 次 振荡/秒）中经受珠子振动2分钟。将180 y 1的粗制溶胞产物转移至新管中，用DNeasy? Blood&Tissue Mini Kit 通过 Qiacube 分离 DNA。
[0169] 细菌16S rRNA基因扩增子测序从50个个体中获取150个牙斑样品并进行分 析，每个个体提供在NG(-21天），基线（0天）和EG(+21天）的三个时间点的样品。采用 45411丨 &11111111，条形码的163扣嫩扩增子测序产生了总共3，181，659个初始序列，得到总共 1,093, 922个处理后的序列（即，质量评价和控制措施后的序列）。每个样品的处理后的序 列的数量在437至28,456的范围内，平均每个样品为7293个序列。所有序列存放在序列 读取档案登录ID SRA058763名下。
[0170] 比较牙斑微生物群的系统发育结构首先在R中用ade4包（Dray S&Dufour AB (2007)The ade4package :Implementing the duality diagram for ecologists. Journal of Statistical Software 22(4) :1_20)进行 PCA 分析，以将不同时间点间微生 物群落结构的差异可视化。普式叠合分析法试图将一个矩阵中的点（诸如通过PCA获得的 点）伸展和旋转，以尽可能靠近其它矩阵的点，从而保留每个矩阵内点之间的相对距离。在 R中使用ade4包进行两个转换后数据的子组（即NG-基线，EG-基线和NG-EG的前四个主 成分的数据矩阵）的简单普式旋转，以测试对于所述组群的微生物群在不同时间点间差异 的程度。
[0171] 也进行主坐标分析（PCoA)已确认在齿龈炎人群和健康人群间微生物群结构的差 异。在每个样品中，通过选择基于UCLUST(EdgarRC(2010)Searchandclusteringorders ofmag