区分儿童潜伏结核感染者和活动性结核病患者的蛋白特征谱的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学领域中区分儿童潜伏结核感染者和活动性结核病患者的蛋 白特征谱。
【背景技术】
[0002] 结核病（Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis， MTB)感染引发的慢性传染性疾病，具有流行性广、病死率高等特点，严重威胁人类健康。近 年来，随着艾滋病以及耐药结核菌的流行，结核病的发病率和病死率居高不下。2012年世界 卫生组织统计数据表明：2011年全球新增结核病患者870万，因结核病或其并发症死亡的 人数多达140万，其中儿童结核病约占全球结核病负担的五分之一。中国是结核病的重灾 区，不仅是全球22个结核病高负担国家之一，也是全球27个耐多药结核病流行严重的国家 之一。结核病人数位居全球第2位，每年新增结核病患者超过100万人，其中超过11万病 例呈现不同程度的耐药。结核病防治形势十分严峻。
[0003] 在群体中，只有约10 %的个体在感染MTB后发展为活动性结核病（Active tuberculosis，ATB)，活动性结核病是指结核病处在活动期，呈现低热和结核中毒症状，具 有传染性，须进行隔离和严格的抗结核治疗。大部分个体感染MTB后呈现带菌生存状态，并 不会发展为ATB，称为潜伏结核感染（Latenttuberculosisinfection,LTBI)。潜伏结核 感染虽然不表现任何结核病的临床症状，但具有发展为活动性结核病的风险。约有10%的 潜伏结核感染者在其一生中会发展为活动性结核病，如此庞大数目的潜伏结核感染者是活 动性结核病的重要来源。因此，有效地区别诊断潜伏结核感染者和活动性结核病患者，并给 予及时相应的疾病监控甚至是预防性治疗，防止潜伏结核感染者发展成为活动性结核病患 者，是防治结核病的关键之一。
[0004]目前针对TB的临床诊断，其金标准仍然是经典的痰涂片染色显微镜下查找抗酸 杆菌以及结核杆菌培养法，已有近百年的历史。这两种检测方法的敏感性均不高，痰涂片染 色法的敏感性约30%，MTB培养法的敏感性约60%，且在儿童TB中的敏感度更低，仅有不 到20%。痰涂片染色法虽然可以当天出结果，但不能区分MTB和非结核分枝杆菌，也不能 区分活菌还是死菌。MTB培养法的敏感性虽高一些，但耗时较长，即使快速培养也需要1个 月的时间才能得到结果。另外，对于肺外结核和涂阴、菌阴的结核病，金标准检测方法的应 用受到限制，加剧了诊断的困难，给及时治疗带来了阻力。近年来虽然陆续出现了一些先进 的基于核酸扩增的分子生物学检测技术（如XpertMTB/RIFassay)，但由于受到仪器设备 和诊断费用的限制，以及假阳性率偏高等问题，还无法全面推广。临床上沿用已久的结核菌 素皮试实验（TST)，容易受到既往BCG疫苗接种和非结核分枝杆菌感染的干扰。特别是在 我国，婴儿出生后即会接种卡介苗，导致TST结果假阳性偏多，诊断不够明确。新近推行的 γ-干扰素释放试验，虽然能够检测MTB感染，但无法区分潜伏结核感染和活动性结核病。 因此，现行的ΤΒ诊断方法或辅助诊断手段都无法实现快速有效的鉴别诊断结核病，使得临 床上面临严重的治疗延误以及治疗性诊断等问题。因此，寻找新的结核病特异标志物，区 别诊断潜伏结核感染和活动性结核病，已经成为结核病临床诊断中一项亟待解决的难题。
[0005] 机体感染MTB后成为潜伏结核感染或者发展为活动性结核病，是由免疫系统与病 原菌间的相互作用决定的。虽然已经确认宿主免疫系统在决定感染结局方面起到重要的作 用，但目前参与这一过程的基因类别和分子机制尚未得到阐明。从潜伏结核感染发展到活 动性结核病，宿主体内必然会经历一系列基因及蛋白表达的改变，其中表达变化较显著的 一些基因和蛋白无疑会成为区别诊断潜伏结核感染和活动性结核病的特异分子标识。既往 研究探讨了在潜伏结核感染和活动性结核病中，某些细胞因子或趋化因子的表达变化。但 这些研究均基于已知的免疫应答信息，检测的数量较少，着眼点也比较局限。同时由于儿童 免疫系统发育尚不完全，在MTB中参与的基因及蛋白的表达变化可能与成人有所不同。因 此，分别针对不同年龄阶段的患者筛选疾病特异性的诊断标记物，将具有更好的临床应用 价值和实际意义。
[0006] 蛋白质组学是在1994年由Williams和Wilkins提出的，通过寻找特异性蛋白质， 为研究疾病机制提供线索。近年来随着人类蛋白质组学计划的全面启动，蛋白质组学的研 究也产生了巨大进展，蛋白质组学研究中应用的定量方法主要有两种，一种是基于传统双 向凝胶电泳及染色基础上的定量，另外一种是基于质谱检测技术的定量，包括标记定量 技术（iTRAQ)和非标记定量技术（Labelfreequantification)两种。非标记定量技术 (Label-freequantification)不需要昂贵的同位素标签做内部标准，实验耗费低；对样本 的操作也最少，从而使其最接近原始状态；并且不受样品条件的限制，克服了标记定量技术 在对多个样本进行定量方面的缺陷，因此它在定量蛋白质组学研究以及诊断标志物筛选 中受到了众多科学工作者的推崇，得到了越来越广泛的应用。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是如何区分儿童潜伏结核感染者和活动性结核病患 者。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测12种蛋白质含量的系统在制备区 分或辅助区分儿童潜伏结核感染者和活动性结核病患者产品中的应用。
[0009] 本发明所提供的检测12种蛋白质含量的系统在制备区分或辅助区分儿童潜伏结 核感染者和活动性结核病患者产品中的应用中，所述12种蛋白质为TSSK4、LOX、RASGRF2、 XRCC4、PAMR1、ZMYM5、ATP11A、SF3B1、NKD2、OCRL、ATG2B和PCF11。
[0010] 所述12种蛋白质构成了区分儿童潜伏结核感染者和活动性结核病患者的蛋白特 征谱，所述特征谱中差异表达的蛋白质为表达上调的蛋白质和表达下调的蛋白质；与儿童 活动性结核病患者相比较，儿童潜伏结核感染者中所述表达上调的蛋白质为TSSK4、L0X和 RASGRF2，所述表达下调的蛋白质为XRCC4、PAMR1、ZMYM5、ATP11A、SF3B1、NKD2、0CRL、ATG2B 和PCF11 ;与儿童潜伏结核感染者相比较，儿童活动性结核病患者中所述表达下调的蛋白 质为TSSK4、L0X和RASGRF2，所述表达上调的蛋白质为XRCC4、PAMR1、ZMYM5、ATP11A、SF3B1、 NKD2、OCRL、ATG2B和PCF11。
[0011] 上述应用中，所述检测蛋白质含量的系统可包括利用液相色谱-电喷雾电离串联 质谱检测蛋白质含量所需的试剂和/或仪器。
[0012] 上述应用中，所述检测蛋白质含量的系统还可包括进行蛋白质的提取、蛋白质的 定量和/或蛋白质的酶解所需的试剂和/或仪器。
[0013] 上述应用中，所述检测蛋白质含量的系统还可包括数据处理系统，所述数据处理 系统用来依据液相色谱-电喷雾电离串联质谱的检测结果确定所述12种蛋白质的含量。所 述数据处理系统可为进行数据分析所需的软件或模块，如提取一级质谱定量信息的软件或 模块、进行蛋白质定量的软件或模块或进行数据检索和整合的软件或模块。所述提取一级 质谱定量信息的软件或模块可为Trans-ProteomicPipeline软件，所述进行蛋白质定量的 软件或模块可为ProfileAnalysis2. 0软件，所述进行数据检索和整合的软件或模块可为 ProteinScape2. 1软件。
[0014] 所述检测蛋白质含量的系统可只由检测蛋白质含量所需的试剂和/或仪器组成， 也可由检测蛋白质含量所需的试剂和/或仪器与下述A1、A2、A3和A4中的至少一种组成：
[0015]A1、进行蛋白质的提取所需的试剂和/或仪器；
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