供了新的筛查方法，同时也为探索疾病发生发展的机制提供了 新的思路。
[0043] 第四，本发明检测方法结果准确，可对儿童结核病做区分诊断，尽早对活动性结核 病患者以及潜伏结核感染者进行治疗。
【具体实施方式】
[0044] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0045] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0046] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0047] 实施例1、儿童潜伏结核感染者和活动性结核病患者差异性蛋白特征谱的建立
[0048] 1、样本和仪器
[0049] 35例选自年龄为3个月-16岁的儿童血浆样本，其中16例为儿童潜伏结核感染 者血浆，另外19例为儿童活动性结核病患者血浆，均有实验室及临床诊断报告确定。活动 性结核病患者的诊断标准为：病原学确诊和临床诊断，具体诊断标准为具有典型的临床症 状和影像学证据，同时存在病原学检测或者组织病理学检测阳性者，同时具有TB患者接触 史、结核菌素试验阳性、抗TB治疗有效、排除其他疾病四项中任意两项者。潜伏结核感染患 儿入组标准为：无临床表现、胸片正常、PH)结果阳性、IFN-γ释放实验结果阳性。
[0050] 所有的血浆样本均在清晨空腹下抽取，分离血浆后储存在-80低温冰箱中。
[0051] 实验用仪器是液相色谱-电喷雾电离串联质谱（Q-ExactiveThermoFinnigan)， 电泳仪（Bio-rad,美国），MultiSkans酶标仪（Thermo,美国），白蛋白/IgG去除试剂盒为 德国Merck公司产品。
[0052] 2、蛋白质提取
[0053] 采用默克公司的ProteoExtract Albumin/IgG Removal Kit去除样本中的高丰度 蛋白（白蛋白/IgG)。去高速离心后的血浆样本50yL，在冰上按使用说明书操作处理，处 理后的样本体积1800μL。
[0054] 由于样本经过去除高丰度蛋白处理后，浓度被稀释了 300倍，因此需要对样本进 行浓缩处理。1800以1^处理后的样本加入81^-20°(：预冷丙酮，沉淀过夜。600(^离心后，弃 去上清，晾干丙酮后，用100μL溶解液（7Μ尿素和2Μ硫脲）溶解沉淀。溶解后的样本4°C 下40000g离心30min，待用。
[0055] 3、蛋白质定量
[0056] 蛋白质定量采用ThermoScientificPierceBCA蛋白定量分析试剂盒，货号为 NCI3225CH，具体方法如下：
[0057]A.方法
[0058] (1)开分光光度计预热20min，选择"光度测量"，调节λ= 595nm。
[0059] (2)用CK(2μL裂解缓冲液 +18μLddH20+lmLBradford)进行调零三次。（要 点：第一次按"Zero"即可，观察第二、三次的0D值，如果都很小且相差不大即可。调零完毕 后，显不 "_0.301Abs"。）
[0060] (3)配置表1中的各牛血清标准蛋白溶液并测定0D595值，绘制标准曲线。
[0061] (4)测B2 (2μLBSA+18μLddH20+lmLBradford)、B5 (5μLBSA+15μLddH20+lmL Bradford)、B8(8yLBSA+12yLddH20+lmLBradford)各三管，用于确定校正系数，校正蛋 白浓度。其中，标准曲线计算方法为：在excel表格中，一列蛋白质浓度，一列对应0D值，插 入图标，选择折线图，选项中选择显示R值和公式。
[0062] 注：BSA为牛血清标准蛋白；要点：所有管加好BSA和ddH20后，加一管Bradford， 测一管；动作要领"三摇一拍";读值为放入比色皿Is后的第一个值；如有数值异常可舍弃 读值或多做一次重复。
[0063] (5)测样品蛋白0D595值。操作同上。将0D595值代入标准曲线方程，得到蛋白浓 度测定值，进而计算实际蛋白浓度，实际蛋白浓度=蛋白浓度测定值X校正系数。
[0064] 表1、牛血清标准蛋白溶液的设置及0D595值测定结果
[0067] 注：0D1_0D5为五个重复。
[0068] B.结果
[0069] 根据表1测定结果，得到标准曲线方程为y= 8.7949X-0.1539,R2=0.9985。其 中，X为0D595，y为蛋白浓度。
[0070] 根据上述步骤（4)计算得到校正系数为0. 9985。
[0071] 进一步，测定步骤2所得的儿童潜伏结核感染者血浆处理后样品中的蛋白浓度为 7. 8μg/μL，儿童活动性结核病患者血浆处理后样品中的蛋白浓度为7. 1μg/μL。
[0072] 4、胰蛋白酶解样本
[0073] (1)蛋白质定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中，用8Μ尿素溶液将体系定至 125yL；
[0074] (2)加入现配的5μL1MDTT溶液至体系中，混匀后，37°C孵育lh;
[0075] (3)加入现配的20μL1MIAA溶液至体系中，混匀后，避光，室温（25°C)反应lh;
[0076] (4)吸取所有样品加入到10kD超滤管中，12000rpm(不超过14000g)离心20min， 弃掉收集管底部溶液；
[0077] (5)加入100μL尿素溶液（8M)至超滤管中，12000rpm离心10min，重复2次。
[0078] (6)在超滤管中加入胰蛋白酶（100U/μg) 2-4μg(与蛋白质量比1:50-100)，体积 50μL，37°C反应过夜20h;次日，12000rpm离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收 集管底部。
[0079] 5、液相分级以及蛋白质质谱检测
[0080] 取酶解产物，按照定量结果取10μg进行LCMSMS分析。采用纳升流速HPLC液 相系统EASY-nLC1000进行分离。液相A液为含有2 % (体积分数）乙腈和0. 1 % (体积 分数）甲酸的水溶液（即以l〇〇mL计算组成如下：2mL乙腈，0.lmL甲酸，余量为水），B液 为含有84% (体积分数）乙腈和0.1% (体积分数）甲酸的水溶液（即以100ml计算组 成如下：84mL乙臆，O.lmL甲酸，余量为水）。色谱柱ThermoEASYcolumnSC200150ym X100mm(RP-C18)以100%的A液平衡。样品由自动进样器上样到ThermoEASYcolumn SC001traps150ymX20mm(RP-C18) (Thermo)，再经色谱柱分离，流速为 400nL/min。相关 液相梯度如下：〇min-100min，B液线性梯度从0%到45% (体积百分比含量，下同）；100 min-108min，B液线性梯度从 45%到 100% ;108min-120min，B液维持在 100%。酶解 产物经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪（ThermoFinnigan)进行质谱分 析。分析时长：120min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300-1800m/z，多肽和多肽的 碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描（fullscan)后采集10个碎片图谱（MS2 scan，HCD)。MSI在M/Z200 时分辨率为 70000,MS2 在M/Z200 时分辨率为 17500。
[0081] 6、质谱鉴定
[0082] 先利用Trans-ProteomicPipeline软件提取一级质谱定量信息（采用软件默 认参数），利用ProfileAnalySiS2. 0软件进行定量（采用软件默认参数）。然后利用 ProteinScape2. 1软件进行数据检索和整合，具体如下：
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