L，逐滴加入98%硫酸21.70 mL。
[0021]3.将0.005g角蛋白粉和0.05g文物样分别溶解于500ml PH为9.6的PBS缓冲溶液中，混合搅拌均匀，静置，分别取80 μ 1上清液加入到酶标板中，形成阳性对照和实验对照。取80μ1 PH为7.4的PBS缓冲溶液作为空白对照用。阴性对照为不加兔抗角蛋白一抗，其包被液和阳性对照设为一样；然后将各阴性对照，阳性对照，实验对照各放置于4 °C冰箱中过夜。
[0022]4.各孔中加入封闭液200 μ 1 ;37°C下封闭1.5h然后将溶液吸出，用PH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤3次，每次3min。
[0023]5.取用封闭液稀释1000-12000倍的兔抗角蛋白抗体80 μ 1加入到酶标板中，保鲜膜封板，37°C下孵育lh ;然后将溶液吸出，用PH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤3次，每次3min。
[0024]6.各孔中加入3000-10000倍稀释的磷酸酯酶山羊抗兔IgG( H+L)抗体80 μ 1 ;37°C下孵育lh ;然后将溶液吸出，用PH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤5次，每次3min。
[0025]7.各孔内加底物显色液100 μ 1，置黑暗处使其反应lOmin ;
8.各孔内加终止液80μ 1，终止反应；
9.将酶标板置于酶标仪中，读取λ=450ηπι处的吸光度数值；比较阳性对照，阴性对照与实验对照测得的0D值；
若0D实验对照/0D阴性对照> 2.1，则证明所检测的样品呈现阳性，说明实验对照中存在角蛋白；
若0D实验对照/0D阴性对照< 2.1，则证明所测得的样品呈现阴性，说明实验对照中不存在角蛋白。
[0026]实施例3
一种羊毛织品中角蛋白的检测方法，具体实施步骤如下:
1.羊毛角蛋白的提取:称取6%的过硫酸氢钾(0Χ0ΝΕ)，加水溶解，用饱和氢氧化钠溶液调节溶液ΡΗ5。以1:50的浴比取羊毛纤维试样放入溶液中，30°C下水浴锅震荡60min。取出羊毛纤维试样后蒸馏水水洗过滤5次，至水洗液pH值为7。洗净的羊毛纤维试样加入到亚硫酸氢钠(5% ￥0、尿素(610、十二烷基苯磺酸钠(3083)(1% wt)的混合溶液中，在100°C下反应4h，后过滤，得到清澈的角蛋白溶液，溶液装入透析袋中(截留分子量14000)，去离子水透析4-5天，直至透析袋中的溶液透明澄清，得到纯净角蛋白溶液，冷冻干燥后获得絮状角蛋白粉末。
[0027]2.溶液配制:PBS7.4 缓冲液配制:KC1 0.2 g，ΚΗ2Ρ04 0.27 g，NaCl 8.0 g，Na2HP04.12H20 3.58 g，用蒸馏水定容至 1000 mL。PBS9.6 缓冲溶液配制:Na2C03 1.5 g，NaHC03 2.9 g，用蒸馏水定容至1000 ml。封闭液(含质量分数1% BSA)配制:BSA 0.1 g，加PBS7.4缓冲液定容至10 mL。底物显色液配制:TMB底物溶液与底物缓冲液以1:1体积混合。终止液(2 mol/L H2S04)配制:蒸馏水178.90 mL，逐滴加入98%硫酸21.70 mL。
[0028]3.将0.0lg角蛋白粉和0.lg文物样分别溶解于1000ml PH为9.6的PBS缓冲溶液中，混合搅拌均匀，静置，分别取120 μ 1上清液加入到酶标板中，形成阳性对照和实验对照。取120 μ 1 PH为7.4的PBS缓冲溶液作为空白对照用。阴性对照为不加兔抗角蛋白一抗，其包被液和阳性对照设为一样；然后将各阴性对照，阳性对照，实验对照各放置于4 °C冰箱中过夜。
[0029]4.各孔中加入封闭液300 μ 1 ;37°C下封闭2h然后将溶液吸出，用PH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤3次，每次3min。
[0030]5.取用封闭液稀释12000倍的兔抗角蛋白抗体120 μ 1加入到酶标板中，保鲜膜封板，37°C下孵育lh ;然后将溶液吸出，用PH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤3次，每次3min 0
[0031]6.各孔中加入3000-10000倍稀释的磷酸酯酶山羊抗兔IgG( H+L)抗体120 μ 1 ；37°C下孵育lh ;然后将溶液吸出，用PH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤5次，每次3min。
[0032]7.各孔内加底物显色液100 μ 1，置黑暗处使其反应lOmin ;
8.各孔内加终止液120μ 1，终止反应；
9.将酶标板置于酶标仪中，读取λ=450ηπι处的吸光度数值；比较阳性对照，阴性对照与实验对照测得的0D值；
若0D实验对照/0D阴性对照> 2.1，则证明所检测的样品呈现阳性，说明实验对照中存在角蛋白；
若0D实验对照/0D阴性对照< 2.1，则证明所测得的样品呈现阴性，说明实验对照中不存在角蛋白。
[0033]最后应当说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
【主权项】
1.一种古代羊毛织品中角蛋白的检测方法，其特征在于利用间接酶联免疫的方法来检测古代羊毛织品中角蛋白成分，即将羊毛织品文物洗脱液包被到酶标板上，然后添加兔抗角蛋白抗体和抗原形成抗原抗体复合物；洗涤后加入碱性磷酸酯酶标山羊抗兔lgG (H+L)抗体，形成抗体-抗原-抗体复合物，洗涤加入TMB显色液，底物被酶催化为有色产物，根据产物颜色变化深浅进行定性分析。2.根据权利要求1所述的古代羊毛织品中角蛋白的检测方法，其特征在于它包括如下步骤: 1)羊毛角蛋白的提取: 称取6%的过硫酸氢钾(OXONE)，加水溶解，用饱和氢氧化钠溶液调节溶液pH3.5-5 ;以1:50的浴比取羊毛纤维试样放入溶液中，30°C下水浴锅震荡60min ;取出羊毛纤维试样后蒸馏水水洗过滤3-5次，至水洗液pH值为7 ;洗净的羊毛纤维试样加入到5% wt的亚硫酸氢钠、6M尿素、1% wt的十二烷基苯磺酸钠的混合溶液中，在100°C下反应4h，后过滤，得到清澈的角蛋白溶液，溶液装入透析袋中，截留分子量14000，去离子水透析4-5天，直至透析袋中的溶液透明澄清，得到纯净角蛋白溶液，冷冻干燥后获得絮状角蛋白粉末； 2)溶液配制:PBS7.4 缓冲液配制:KC1 0.2 g，ΚΗ2Ρ04 0.27 g，NaCl 8.0 g，Na2HP04.12HzO 3.58 g，用蒸馏水定容至1000 mL ; PBS9.6缓冲溶液配制:Na2C03 1.5 g，NaHC03 2.9 g，用蒸馏水定容至1000 ml ； 封闭液(含质量分数1% BSA)配制:BSA 0.1 g，加PBS7.4缓冲液定容至10 mL ; 底物显色液配制:TMB底物溶液与底物缓冲液以1:1体积混合； 终止液(2 mol/L H2S04)配制:蒸馏水178.90 mL，逐滴加入98%硫酸21.70 mL ； 3)将0.001g-0.0lg角蛋白粉和0.01g-0.lg文物样分别溶解于100-1000ml PH为9.6的PBS缓冲溶液中，混合搅拌均匀，静置，分别取50-120 μ 1上清液加入到酶标板中，形成阳性对照和实验对照；取50-120 μ 1 PH为7.4的PBS缓冲溶液作为空白对照用；阴性对照为不加兔抗角蛋白一抗，其包被液和阳性对照设为一样；然后将各阴性对照，阳性对照，实验对照各放置于4°C冰箱中过夜； 4)各孔中加入封闭液100-300μ l ;37°C下封闭l_2h然后将溶液吸出，用PH为.7.4的PBS缓冲溶液洗涤3次，每次3min; 5)取用封闭液稀释1000-12000倍的兔抗角蛋白抗体50-120μ 1加入到酶标板中，保 鲜膜封板，37°C下孵育lh ;然后将溶液吸出，用PH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤3 次，每次3min ； 6)各孔中加入3000-10000倍稀释的磷酸酯酶山羊抗兔IgG( H+L)抗体50-120 μ 1;37°C下孵育lh ;然后将溶液吸出，用PH为7.4的PBS缓冲溶液洗涤5次，每次.3min ； 7)各孔内加底物显色液100μ l，置黑暗处使其反应lOmin ; 8)各孔内加终止液50-120μ l，终止反应； 9)将酶标板置于酶标仪中，读取λ=450ηπι处的吸光度数值；比较阳性对照，阴性对照与实验对照测得的0D值； 若0D实验对照/0D阴性对照> 2.1，则证明所检测的样品呈现阳性，说明实验对照中存在角蛋白； 若0D实验对照/0D阴性对照< 2.1，则证明所测得的样品呈现阴性，说明实验对照中不存在角蛋白。
【专利摘要】本发明公开了一种古代羊毛织品中角蛋白的检测方法，利用间接酶联免疫的方法来检测古代羊毛织品中角蛋白成分，即将羊毛织品文物洗脱液包被到酶标板上，然后添加兔抗角蛋白抗体和抗原形成抗原抗体复合物。洗涤后加入碱性磷酸酯酶标山羊抗兔lgG（H+L）抗体，形成抗体-抗原-抗体复合物，洗涤加入TMB显色液，底物被酶催化为有色产物，根据产物颜色变化深浅进行定性分析。本发明的有益效果是：1、本发明提取角蛋白中采用阴离子表面活性剂SDBS成本低，临界胶束浓度低，用量少。2、本发明采用间接酶联免疫的方法对羊毛织品中的角蛋白成分进行检测，一方面灵敏度高、操作简单。另一方面，避免了其它蛋白的干扰，特异性强。
【IPC分类】G01N33/535
【公开号】CN105353118
【申请号】CN201510767286
【发明人】刘杨, 王秉, 游秋实
【申请人】浙江理工大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月12日