用于尿白蛋白和尿肌酸酐的快速检测的制作方法
【专利说明】用于尿白蛋白和尿肌酸酐的快速检测发明领域
[0001]利用侧流层析法测量白蛋白和肌酸酐水平、以及白蛋白-肌酸酐比率的方法和设备。
[0002]发明背景
[0003]白蛋白-肌酸酐比率(ACR)测定同时测量尿中的两种分析物:白蛋白和肌酸酐。当机体正确地行使功能时，白蛋白在正常情况下不出现在尿中，因为它通过肾脏的作用被留在血流中。当少量白蛋白从肾脏排出到尿中时，存在被称为微量白蛋白尿的病症。当白蛋白从肾脏异常渗漏至尿中时，出现微量白蛋白尿。
[0004]肌酸酐是肌肉中的磷酸肌酸的副产物。在正常行使功能的机体中，肌酸酐以恒定速率被排出到尿中。当同时测量白蛋白和肌酸酐时，结果被称为白蛋白-肌酸酐比率。由于利尿输出和患者的水化状态不同，所以使用ACR来确定尿中的白蛋白以校正尿的浓度。
[0005]具有糖尿病或高血压的个体中的微量白蛋白尿已显示出与发生神经病、心血管疾病(CVD)、视网膜病、惊厥前期、炎性病症和死亡的风险提高相关联。ACR测定作为肾脏损伤的早期检测方法以及疗效的监测方法。ACR测定常用于具有慢性疾病(例如，糖尿病和高血压)且发生肾衰竭的风险提高的患者。
[0006]现有的肌酸酐测量方法包括比色实验，包括基于Jaffe’ s反应的化学方法，其使用碱性苦味酸；和酶法，通过该方法，利用肌酸酶转化肌酸酐，通过过氧化物酶产生颜色强度和测量反应性底物。
[0007]通过四种方法中的一种测量尿中的白蛋白，包括比色法，通过该方法，染料与白蛋白分子直接反应，从而形成有色的白蛋白-染料复合体；或免疫学方法，该方法使用比浊法(nephelometry)或池度测定法(turbidimetry);和基于经标记抗体的竞争性或夹心免疫测定法。
[0008]目前用于进行白蛋白-肌酸酐比率检测的方法操作复杂或需要昂贵的仪器且一般在临床实验室进行。开发可以为照护点(point-of-care)产品或柜台售卖(over-the-counter)产品的简化测定将是有利的。
[0009]发曰月概沐
[0010]本文公开了简化的用于分析物和分析物比率测定的照护点测定，其利用一次性检测条(strip)和可重复使用的测量仪器。所公开的方法和设备利用侧流免疫层析法的原理以在单个测定中测量尿白蛋白和尿肌酸酐二者并测定白蛋白-肌酸酐比率(ACR)。将患者的尿样品放置在检测盒中，所述检测盒含有用于进行检测的试剂。然后将检测盒插入读取、计算和报告结果的检测盒读取器中。
[0011]在一个实施方式中，公开了用于测定人样品中白蛋白-肌酸酐比率的设备，所述设备包含含有检测条的检测盒，其中所述检测条包含:单个样品施加垫，其含有放置在固体支持物上的样品孔；缀合物垫，其中放置有肌酸酐-特异性缀合物和白蛋白-特异性缀合物；侧流膜；肌酸酐-特异性检测区，其中存在于样品中且与肌酸酐-特异性缀合物结合的肌酸酐通过与膜相关联的肌酸酐-特异性固定剂被保留；肌酸酐-特异性对照区，其中未被肌酸酐-特异性检测区保留的肌酸酐-特异性缀合物通过与膜相关联的肌酸酐缀合物-特异性固定剂被保留；白蛋白-特异性检测区，其中存在于样品中且与白蛋白-特异性缀合物结合的白蛋白通过与膜相关联的白蛋白-特异性固定剂被保留；白蛋白-特异性对照区，其中未被白蛋白-特异性检测区保留的白蛋白-特异性缀合物通过与膜相关联的白蛋白缀合物-特异性固定剂被保留；储存器；用于测定样品中白蛋白浓度、样品中肌酸酐浓度、和白蛋白-肌酸酐比率的测量设备。
[0012]在所述设备的另一实施方式中，所述样品是尿样品。在另一实施方式中，所述设备是侧流免疫层析设备。在另一实施方式中，所述测量设备读取、计算并展示结果为样品中白蛋白浓度、样品中肌酸酐浓度、和白蛋白-肌酸酐比率。在另一些实施方式中，所述测量设备是反身才分光计(reflectance spectrometer)或焚光计(fluorometer)。
[0013]在设备的另一些实施方式中，肌酸酐-特异性缀合物是对肌酸酐特异的抗体。在另一实施方式中，肌酸酐-特异性固定剂是肌酸酐。在另一实施方式中，肌酸酐与载体蛋白结合，所述载体蛋白例如牛血清白蛋白、钥孔戚血蓝蛋白或卵白蛋白。在另一实施方式中，肌酸酐缀合物-特异性固定剂是对肌酸酐-特异性抗体的种类(species)特异的抗体。
[0014]在设备的另一实施方式中，白蛋白-特异性缀合物是对白蛋白特异的抗体。在另一实施方式中，白蛋白-特异性固定剂是人血清白蛋白。在另一实施方式中，白蛋白缀合物-特异性固定剂是对白蛋白-特异性抗体的种类特异的抗体。
[0015]在设备的某些实施方式中，任何抗体是来自兔、鸡、山羊、豚鼠、仓鼠、马、小鼠、大鼠或绵羊的单克隆抗体或多克隆抗体。
[0016]在设备的另一实施方式中，用可检测部分标记肌酸酐-特异性缀合物和白蛋白-特异性缀合物，所述可检测部分是微粒或染料。所述微粒是胶体金颗粒、聚苯乙烯颗粒、丙烯酸颗粒、磁性颗粒或其它固相微粒，且可被荧光化合物着色或标签化。
[0017]在设备的另一实施方式中，单个样品施加垫、缀合物垫、肌酸酐-特异性检测区、肌酸酐-特异性对照区、白蛋白-特异性检测区、白蛋白-特异性对照区、和储存器全部放置在单个检测条上。在另一实施方式中，检测条被装在刚性盒中。
[0018]在设备的另一实施方式中，所述设备包含2个检测条，其中第一检测条包含:含肌酸酐-特异性缀合物的第一缀合物垫、肌酸酐-特异性检测区、肌酸酐-特异性对照区、和第一储存器；且第二检测条包含:含白蛋白-特异性缀合物的第二缀合物垫、白蛋白-特异性检测区、白蛋白-特异性对照区、和第二储存器；其中所述第一检测条和所述第二检测条被排列成平行、彼此相对、或彼此成一定角度的构型以使所述第一检测条和所述第二检测条共享单个样品施加垫。在另一实施方式中，所述第一检测条和所述第二检测条被装在单个刚性盒中。
[0019]本文还公开了测定样品中白蛋白-肌酸酐比率的方法，所述方法包括:将样品放入根据权利要求1的检测盒的样品施加垫中，其中样品进入缀合物垫并被暴露于肌酸酐-特异性缀合物和白蛋白-特异性缀合物，其中样品中的肌酸酐与肌酸酐-特异性缀合物结合且样品中的白蛋白与白蛋白-特异性缀合物结合，其中结合肌酸酐的肌酸酐-特异性缀合物与肌酸酐检测区中的肌酸酐-特异性固定剂结合并且未结合的物质被传递到肌酸酐-特异性对照区，所述肌酸酐-特异性对照区与未结合肌酸酐-特异性固定剂的肌酸酐-特异性缀合物结合，以及其中结合白蛋白的白蛋白-特异性缀合物与白蛋白检测区中的白蛋白-特异性固定剂结合并且未结合的物质被传递到白蛋白-特异性对照区，所述白蛋白-特异性对照区与未结合白蛋白-特异性固定剂的白蛋白-特异性缀合物结合，其中样品与缀合物反应并到达终点的时间为约2分钟至约30分钟；将所述检测盒插入测量设备中；提供来自所述样品的肌酸酐浓度、白蛋白浓度、和白蛋白-肌酸酐比率的数值结果。
[0020]在所述方法的另一实施方式中，所述样品是尿样品。在另一实施方式中，所述检测盒是侧流免疫层析设备的一部分。在另一实施方式中，所述测量设备读取、计算并展示结果为样品中白蛋白浓度、样品中肌酸酐浓度、和白蛋白-肌酸酐比率。
[0021]在所述方法的另一实施方式中，样品与缀合物反应并到达终点的时间为约7分钟至约25分钟、约10分钟至约20分钟、或约15分钟。
[0022]在所述方法的另一些实施方式中，肌酸酐-特异性缀合物是对肌酸酐特异的抗体。在另一实施方式中，肌酸酐-特异性固定剂是肌酸酐。在另一实施方式中，肌酸酐与载体分子结合，所述载体分子例如牛血清白蛋白、钥孔戚血蓝蛋白、卵白蛋白、或树形分子(dendrimers)。在另一实施方式中，肌酸酐缀合物_特异性固定剂是对肌酸酐_特异性抗体的种类特异的抗体。
[0023]在所述方法的另一实施方式中，白蛋白-特异性缀合物是对白蛋白特异的抗体。在另一实施方式中，白蛋白-特异性固定剂是人血清白蛋白。在另一实施方式中，白蛋白缀合物-特异性固定剂是对白蛋白-特异性抗体的种类特异的抗体。
[0024]在所述方法的某些实施方式中，任何抗体是来自兔、鸡、山羊、豚鼠、仓鼠、马、小鼠、大鼠或绵羊的单克隆抗体或多克隆抗体。
[0025]在所述方法的另一实施方式中，用可检测部分标记肌酸酐-特异性缀合物和白蛋白-特异性缀合物，其中所述可检测部分是微粒或染料。所述微粒是胶体金颗粒、聚苯乙烯颗粒、丙烯酸颗粒、磁性颗粒或其它固相微粒，且可被荧光化合物着色或标签化。
[0026]在所述方法的另一实施方式中，单个样品施加垫、缀合物垫、肌酸酐-特异性检测区、肌酸酐-特异性对照区、白蛋白-特异性检测区、白蛋白-特异性对照区和储存器全部放置在单个检测条上。在另一实施方式中，检测条被装在刚性盒中。
[0027]在所述方法的另一实施方式中，所述设备包含2个检测条，其中第一检测条包含:含肌酸酐-特异性缀合物的第一缀合物垫、肌酸酐-特异性检测区、肌酸酐-特异性对照区、和第一储存器；且第二检测条包含:含白蛋白-特异性缀合物的第二缀合物垫、白蛋白-特异性检测区、白蛋白-特异性对照区、和第二储存器；其中所述第一检测条和所述第二检测条被排列成平行、彼此相对，或彼此成一定角度的构型以使所述第一检测条和所述第二检测条共享单个样品施加垫。在另一实施方式中，所述第一检测条和所述第二检测条被装在单个刚性盒中。
[0028]本文还公开了用于测定白蛋白-肌酸酐比率的试剂盒，其包含:至少一个检测盒；可重复使用的检测设备；和从样品测定白蛋白-肌酸酐比率的说明。在另一实施方式中，试剂盒还包含运行缓冲液(running buffer)。
[0029]在所述试剂盒的一个实施方式中，检测盒包含:检测条，其中所述检测条包含:单个样品施加垫，其含有放置在固体支持物上的样品孔；缀合物垫，其中放置有肌酸酐-特异性缀合物和白蛋白-特异性缀合物；侧流膜；肌酸酐-特异性检测区，其中存在于样品中且与肌酸酐-特异性缀合物结合的肌酸酐通过与膜相关联的肌酸酐-特异性固定剂被保留；肌酸酐-特异性对照区，其中未被肌酸酐-特异性检测区保留的肌酸酐-特异性缀合物通过与膜相关联的肌酸酐缀合物-特异性固定剂被保留；白蛋白-特异性检测区，其中存在于样品中且与白蛋白-