一种坤灵丸的高效液相指纹图谱检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种坤灵丸的高效液相指纹图谱检测方法，属于药物分析技术领域。
【背景技术】
[0002] 坤灵丸是一种中药复方制剂，其功能主治为调经养血，逐癒生新。用于月经不调， 或多或少，行经腹痛，子宫寒冷，久不受孕，习惯性流产，赤白带下，崩漏不止，病久气虚，肾 亏腰痛。
[0003] 坤灵丸的处方如下：
[0004] 【处方】
[0005] ( -）香附（制）37g甘草7g白薇14g益母草14g黄茂14g鸡冠花14g麦冬 14g北五味子14g地黄14g红花14g木通lOg白术（炒）14g赤石脂14g巧冬14g厚朴 lOg肉巧蓉（制）14g白巧（酒炒）14g
[0006] (二）香附（制）37g荆芥lOg牡丹皮14g阿胶14g当归14g蔓本lOg红参14g 鹿角胶14g川贝母14g没药（炒）14g砂仁14g延胡索14g小茵香（盐制）14g龟甲胶 14g川写14g
[0007] 【制法】W上处方（一）十走味，加水煎煮二次，第一次3小时，第二次2小时，合并 煎液，滤过，滤液放置24小时，取上清液加入米醋280g，浓缩成稠膏。W上处方（二）十五 味，粉碎成中粉，加入上述稠膏中，混匀，干燥，粉碎成细粉，过筛，混匀，用黄酒泛丸，制成 1800丸，包糖衣或薄膜衣，打光，干燥，即得。
[0008] 由于中药化学成分复杂，作用机制不明确，致使现有中药制药技术难W确保中药 产品质量稳定性，中药指纹图谱建立的可W全面反映中药内在化学成分的种类与数量，进 而反映中药的质量。现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式， 将有效地表征中药质量。指纹图谱已为国际社会所认可，有利于中药及产品进入国际市场。
[0009] 坤灵丸现行标准收载于中华人民共和国卫生部药品标准《中药成方制剂》第十册， 标准中未涉及任何针对药味的定性定量控制项目，目前，没有对坤灵丸进行指纹图谱研究 的报道，而指纹图谱能充分表征中药制剂的整体性和复杂性，因此发明人对坤灵丸的有效 成分进行了研究。发现其中含有多种水溶性与醇溶性成分，本发明人有针对性的对送些成 分进行了研究，建立了一种坤灵丸的标准指纹图谱，利用该图谱对生产中的坤灵丸进行质 量监督，W确保产品质量。
【发明内容】
：
[0010] 本发明提供一种坤灵丸高效液相标准对照指纹图谱，其建立方法如下：
[0011] 1)供试品溶液制备：
[0012] 取坤灵丸，加入甲醇或己醇水溶液，超声溶解，再加入溶剂调整溶液浓度，微孔滤 膜滤过，取滤液，既得；
[001引。获得色谱图：
[0014] 供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图；
[0015] 3)生成对照指纹图谱
[0016] 选择合格的多批坤灵丸色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价 系统A版"软件，计算得相似度结果，并生成标准对照指纹图谱；
[0017] 其中高效液相色谱的色谱条件如下：
[0018] 色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料，（4. 6巧50mm，5um);流动相为己 腊-0. 1 %~5%甲酸水溶液梯度洗脱，见表1 ;流速为0. 6~1. 5ml/min ;柱温为25~4(TC; 进样量为5~20 μ L ;检测波长为274皿。
[0019] 梯度洗脱表：
[0020]
[0024] 根据需要可W加入有效成分的标准对照品W作为参照物峰。
[00巧]其中，优选的标准对照指纹图谱的建立方法如下：
[002引1)供试品溶液的制备，方法如下：
[0027] 取坤灵丸适量（糖衣丸除去糖衣），研成细粉，精密称取0. 3~0. 7g至5~15ml 容量瓶中，加30%~70%甲醇适量，超声处理20~40min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀， 过0.45 μ m微孔滤膜，取续滤液即得。优选，取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精 密称取0. 5g至10ml容量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻 度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液即得。
[002引 。W丹皮酪作为参照物制备标准对照品溶液，方法如下：
[0029] 精密称取丹皮酪对照品适量，加30%~70%甲醇溶解制成每1ml含8~20 μ g的 溶液，即得；优选加50%甲醇制成每1ml含15 μ g的溶液。
[0030] 扣标准对照指纹图谱的确定，方法如下：
[0031] 将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，
[0032] 将多批坤灵丸样品的指纹图谱中8个峰为共有峰，利用中药色谱指纹图谱相似度 评价系统（2. 0版），拟合确定坤灵丸对照指纹图谱，其中，与丹皮酪对照品峰保留时间相同 的色谱峰为6号峰，其他7个色谱峰的相对保留时间分别为；0. 08 (1)、0. 13 (2)、0. 14(3)、 0. 57 (4)、0. 79 巧）、1. 00 化）、1. 08 (7)、1. 13 (8)，各峰的相对保留时间在 ±3% ~±10%W 内
[0033] 本发明还提供一种坤灵丸的高效液相色谱指纹图谱检测方法，其特征在于，包括 如下步骤
[0034] 1)待测样品溶液的制备：
[0035] 取坤灵丸样品，加入甲醇或己醇水溶液，超声溶解，再加入溶剂调整溶液浓度，微 孔滤膜滤过；
[0036] 2)待测样品溶液指纹图谱的测定：
[0037] 取滤液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图：
[0038] 其中的色谱条件如下：
[0039] 色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填料（4. 6巧50mm，5um);流动相为己 腊-0. 1%~5%甲酸水溶液梯度洗脱，见表1 ;流速为0. 6~1. 5ml/min ;柱温为25~4(TC; 进样量为5-20 μ L ;检测波长为272-276皿。
[0040] 优选W己腊-1 %甲酸为流动相；流速1. 0ml/分钟；柱温30。进样量为10 μ L ;检 测波长；274皿。
[0041] 表1梯度洗脱表
[0042]
[0043] 洗脱表优选：
[0044]
[0045] 3)待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
[0046] 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版"软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度；
[0047] 其中，优选的本发明的待测样品溶液的制备如下：
[0048] 取坤灵丸适量（糖衣丸除去糖衣），研成细粉，精密称取0. 3~0. 7g至5~15ml 容量瓶中，加30%~70%甲醇适量，超声处理20~40min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀， 过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图；
[0049] 优选，；取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取0. 5g至10ml容量瓶 中，加50 %甲醇适量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤 膜，取续滤液既得。
[0050] 其中，待测样品色谱图和标准对照指纹图谱相似度计算：
[0051] 将待测样品的色谱图导入中国药典委的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版"软件，比较待测样品的色谱图和标准对照指纹图谱相似度；相似度为0. 90 W上为合格， 相似度为0. 95 W上为相符，相似度为0. 98 W上为相同。
[0052] 本发明通过W上指纹图谱的建立，进一步的确立了坤灵丸的分析方法，采用该方 法可W隹确辨别坤灵丸，根据和标准指纹图谱的比较，得出鉴别结论，越和标准指纹图谱接 近，产品质量越好，相似度可W使用计算机方法确认，如相似度为0. 90 W上为合格，相似度 为0. 95 W上为相符，相似度为0. 98 W上为相同。
[0053] 上述方法特别是坤灵丸的标准对照指纹图谱的制备方法是经过筛选获得的，W下 为筛选过程：
[0054] 1. 1仪器与试药
[00巧]仪器；Waters2695-2996高效液相色谱仪；Empower II色谱工作站；Milli-Q超纯 水器；万分之一天平（赛多利斯）；十万分之一天平（赛多利斯）。
[0056] 色谱柱；Agilent Z0RBAX(4. 6巧50mm，5 μ m);
[0057] 试剂；甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；己腊（色谱纯，天津市康科德 科技有限公司）；甲酸（分析纯，天津市化学试剂一厂）；水为超纯水。
[0058] 对照品；中国药品生物制品检定所；丹皮酪（批号：110708-200506,含量测定用，
[0059] 为中国药品生物制品检定所提供；
[0060] 样品；坤灵丸（天津天±力（迂宁）制药有限责任公司，共11化具体批号见表2， 均经质检中必检验合格。
[0061] 表2坤灵丸样品信息表
[0062]
[0063]
[0064] 1. 2分析条件的选择
[0065] 1. 2. 1检测波长的选择
[0066] 参照产品中丹皮酪含量测定色谱条件，选用色谱柱；Agilent Z0RBAX SB-Cis (4. 6 X 250mm，5 μ m)，W表3中梯度洗脱条件洗脱，进行检测波长的选择考察。
[0067] 表3梯度洗脱表
[0068]
[0069] 文献报道的检测波长常常是为测定某一特定成分的含量，不一定完全适合指纹图 谱的需要，为了获得多层次的信息，需要选择数个不同的检测波长，同时坤灵丸为大复方制 剂，含有31味中药材，其所含化学成分很多。因此，在试验中应使用DAD检测器全波长检测 获得3D指纹图谱，见图1。结果表明274nm处可W得到较多的化学信息，故选择274nm作为 检测波长，见