羊耳菊药材的多成分含量测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及药物成份鉴别和质量检测技术领域，具体设及一种测定羊耳菊药材中 多种成分含量的方法。
【背景技术】
[0002] 羊耳菊为菊科植物羊耳菊Inula cappa(Buch.-Ham.ex D.Don)DC.的干燥全草， 具有疏风散热，解毒消肿功效，是贵州苗族常用药材，苗语药名为"Bex nioux dant"(近似 汉译音为"白牛胆"），在《苗族医药学》、《中华本草·苗药卷》、2003版《贵州省中药、民族药质 量标准》中均有收载，贵州省W羊耳菊为原料研制的"屯神喉搏通颗粒"、"鼻康片"、"羊甘滴 丸"等各种苗药制剂相继上市销售，疗效显著，创造了良好的社会经济效益。在俸族，羊耳菊 又名"纳罕"，为俸医名方"雅叫哈顿散"（收载于2010年版中国药典一部)的主药。《中国民族 药志》记载:除苗族、俸族外，羊耳菊在我国壮、個、景颇、拉枯、傑傑、苗、彝、化等少数民族地 区均有丰富的药用经验，常用于感冒发热，咽喉肿痛，风湿疼痛，痴疮疗毒，乳痴等症，有独 特疗效。但羊耳菊基础研究薄弱一直是亟待解决的技术问题，特别是羊耳菊的质量控制水 平低，很难保证羊耳菊及其相关产品的质量和疗效。
[0003] 近年来对羊耳菊的化学成分研究报道较多，其主要成分有酪类、倍半祗类、有机酸 类、黄酬类和挥发油类等，但目前关于羊耳菊的质量研究却较少。《贵州省中药、民族药质量 标准》中尚未收载羊耳菊的含量测定项目，经文献查阅，也仅有羊耳菊单一成分及总黄酬测 定，不能全面反映其内在质量。现有技术表明，羊耳菊中东赏窘巧、1,3-0-二咖啡酷基奎宁 酸、木犀草巧，3，4-0-二咖啡酷基奎宁酸、3，5-0-二咖啡酷基奎宁酸和4，5-0-二咖啡酷基奎 宁酸等六种成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化及抗病毒等药理作用，因此，建立羊耳菊中上述6 个成分的含量测定方法能够为有效控制羊耳菊的内在质量提供科学依据。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了更加全面的鉴别和控制羊耳菊药材的质量，提供一种采用 UPLC-MS/MS法测定羊耳菊药材中六种成分的方法，W测定出羊耳菊中羊耳菊中东赏窘巧、 1，3-0-二咖啡酷基奎宁酸、木犀草巧，3，4-0-二咖啡酷基奎宁酸、3，5-0-二咖啡酷基奎宁酸 和4,5-0-二咖啡酷基奎宁酸等六种成分含量。
[0005] 基于上述目的，本发明是运样一种羊耳菊药材的多成分含量测定方法，该方法包 括采用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定羊耳菊药材中东赏窘巧、1,3-0-二 咖啡酷基奎宁酸、木犀草巧、3，4-0-二咖啡酷基奎宁酸、3，5-0-二咖啡酷基奎宁酸、4，5-0- 二咖啡酷基奎宁酸6个成分的含量的步骤，在超高效液相色谱串联质谱分析中包括W葛根 素为内标。
[0006] 在超高效液相色谱串联质谱分析中采用Waters邸Η C18(2.1 mmXlOO mm，1.7 μ m)色谱柱。
[0007] 在超高效液相色谱串联质谱分析中采用0.1%甲酸乙腊(A)-O.l%甲酸水(B)为流动 相进行梯度洗脱。该梯度洗脱的程序如下：ο~1.0 min,5%~15%(A); 1.0~3.8 min, 15%~18% (A);3.8~4.0min，18%~90%(A);4.0~5.0min，90%~5%(A)。
[000引在超高效液相色谱串联质谱分析中包括还包括电喷雾电离源(ESI)，W多反应离 子监测(MRM)检测的步骤。它的质谱条件是：采用电喷雾电离源化SI)，毛细管电离电压3 kV，离子源溫度120 °C ;去溶剂气化，流速650 L/h，去溶剂气溫度350 °C，离子源溫度120 °C ;碰撞气Ar，流速0.16 mL/min;扫描方式为多反应离子监测(MRM)。
[0009] 该方法中，内标溶液的制备方法如下:精密称取葛根素，用甲醇定容，获得葛根素 的储备液;取内标储备液适量至容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成20 pg/mL的内标溶 液，冷冻保存备用。
[0010] 供试品溶液制备方法如下：取羊耳菊细粉约l.OOOOg，精密称定，置圆底烧瓶中， 加入25%乙醇25血，称定重量(精确至0.0 lg)，加热回流提取2 h，放冷，再称定重量，用提取 液补足减失的重量，摇匀，过滤，精密吸取续滤液5 mL于蒸发皿，挥干溶剂;残余物转移至25 mL容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45皿)滤过，取续滤液，即得； 对照品溶液制备方法如下：：分别精密称取东赏窘巧等6种对照品，各置10 mL容量瓶 中，加甲醇定容至刻度处，摇匀；得东赏窘巧（0.504 mg/mL)、l ,3-0-二咖啡酷基奎宁酸 (1.037 mg/mL)、木犀草巧(0.856 mg/mL)、3,4-0-二咖啡酷基奎宁酸（1.007 mg/mL)、3,5- 0-二咖啡酷基奎宁酸(0.502 mg/mL)、4，5-0-二咖啡酷基奎宁酸（1.073 mg/mL)的储备液。
[0011] UPLC-MS/MS专属性强，灵敏度高，快速准确，越来越多地应用于中药材质量控制等 各方面的研究中，因此本发明应用UPLC-MS/MS，W葛根素为内标，建立羊耳菊中6个成分的 含量测定方法，国内外未见相关文献报道，为有效控制羊耳菊的内在质量提供了科学依据。
[0012] 本发明中，WLC使用1.7皿颗粒度的色谱柱填料，能显著提高分离的效率，WLC- MS/MS法在不影响分离效果的情况下大大提高了样品中各成分的分析速度。本发明首次建 立了羊耳菊药材的多指标成分含量测定方法，且采用UPLC-MS/MS法，在6 min内即可同时 准确测定羊耳菊中6个成分的含量，为羊耳菊的质量控制提供了一种快速灵敏、稳定可靠的 新方法。
[0013 ] 本发明实验中考察了 W甲醇、无水乙醇、25%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和水 为提取溶剂，分别用索氏提取、回流提取和超声处理，W及不同时间对羊耳菊进行提取，对 测定结果综合分析后，最后采用25%乙醇加热回流提取2 h，6种成分的提取效率较好。
【附图说明】
[0014] 图1是混合对照品溶液(A)和供试品溶液(B)的UPLC-MS/MS图谱；其中：1.东赏窘 巧，2.葛根素，3. 1,3-0-二咖啡酷基奎宁酸，4.木犀草巧，5. 3,4-0-二咖啡酷基奎宁酸， 6. 3,4-0-二咖啡酷基奎宁酸，7. 4,5-0-二咖啡酷基奎宁酸。
【具体实施方式】
[0015] 为了更加清楚的对本发明进行说明，W下通过具体实施实例对本发明的具体实施 方式进行更为详细的说明。但是应该理解，W下所述具体实施实例仅用于本发明进行示例 性说明，而非用于本发明进行任何性质限定，其中所用材料、试剂、仪器及操作条件仅为代 表性的，其并不限于所列举的情况。所属技术领域的技术人员通过阅读W下说明可W对本 发明做出不脱离本发明权利要求所限定的保护范围的改动和改进，运些改动和改进也处于 本发明所要求保护的范围内。
[0016] 1仪器与试药 1.1仪器 ACQUITY系统超高效液相色谱-Ξ重四级杆串联质谱仪，包括二元梯度累、自动进样器、 柱溫箱、Ξ重四级杆质量分析器和Masslynx4.1质谱工作站(美国waters公司）。
[0017] 1.2 试药 东赏窘巧对照品（批号13061442，纯度含98%)由上海同田生物技术有限公司提供；1， 3-0-二咖啡酷基奎宁酸、3,4-0-二咖啡酷基奎宁酸、3,5-0-二咖啡酷基奎宁酸、4,5-二-0- 咖啡酷基奎宁酸对照品（均由中药固体制剂制造技术国家工程研究中屯、提供，批号分别为 1384-101215、1384-101215、5：34-110121、1384-101215、纯度>98〇/〇);葛根素和木犀草巧对 照品（均由中国食品药品检定研究院提供，批号分别为111-090623、111720-200602纯度> 98%);甲醇（天津科密欧化学试剂有限公司）、乙腊(德国Merck公司）、甲酸（美国TEDIA有限 公司）为色谱纯;其他试剂均为分析纯，水为超纯水。羊耳菊药材:共6批样品，来源于贵州高 坡、龙里及罗甸等地，由贵阳医学院龙庆德副教授鉴定为菊科植物羊耳菊Inula cappa (Buch.-Ham. ex D. Don) DC.的干燥全草。
[001引 2方法与结果 2.1溶液配制 对照品溶液:分别精密称取东赏窘巧等6种对照品，各置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至 刻度处，摇匀。得东赏窘巧(0.504 mg/mL)、1，3-0-二咖啡酷基奎宁酸（1.037 mg/mL)、木犀 草巧(0.856 mg/血）、3,4-0-二咖啡酷基奎宁酸（1.007 mg/血）、3,5-0-二咖啡酷基奎宁酸 (0.502 mg/mL)、4,5-0-二咖啡酷基奎宁酸（1.073 mg/mL)的储备液。
[0019] 内标溶液:精密称取葛根素（1.148 mg)，用甲醇定容至10血。获得葛根素(0.1148 mg/mL)的储备液。取内标储备液适量至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成20 pg/ mL的内标溶液，置冰箱(-20 °C)保存，备用。
[0020] 供试品溶液:取羊耳菊细粉约l.OOOOg，精密称定，置圆底烧瓶中，加入25%乙醇25 mL，称定重量(精确至0.0 lg)，加热回流提取2 h，放冷，再称定重量，用提取液补足减失的重 量，摇匀，过滤，精密吸取续滤液