5 mL于蒸发皿，挥干溶剂;残余物转移至25 mL容量瓶，加甲 醇至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45皿)滤过，取续滤液，即得。
[0021] 2.2色谱条件 色谱柱：Waters 肥 Η Ci8(2.1 mmXlOO mm，1.7 μηι)柱，保护柱：Waters Van 加 ard B邸Cl8(2.1mX5mm，1.7μm);柱溫:45°C;流速:0.35mL/min;进样体积为lμレ流动相： 0.1%甲酸乙腊^)-0.1%甲酸水(8)，梯度洗脱，洗脱程序如下：0~1.0 111111，5%~15%^);1.0~ 3.8min，15%~18%(A);3.8~4.0min，18%~90%(A);4.0~5.0min，90%~5%(A)。
[0022] 2.3质谱条件 采用电喷雾电离源化SI)，毛细管电离电压3 kV，离子源溫度120 °C ;去溶剂气化，流 速650 L/h，去溶剂气溫度350 °C，离子源溫度120 °C ;碰撞气Ar，流速0.16 mL/min。扫描 方式为多反应离子监测(MRM)，监测离子见表1。
[0023] 表1质谱条件
表1注:分析物1-7分别为东赏窘巧、1,3-0-二咖啡酷基奎宁酸、木犀草巧、3,4-0-二咖 啡酷基奎宁酸、3,5-0-二咖啡酷基奎宁酸、4,5-0-二咖啡酷基奎宁酸及葛根素。
[0024] 2.4专属性试验 精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液适量并加入内标(葛根素)溶液，15000 rpm，离 屯、5 min取上清液1 pL进样，结果见图1。由图可见，被测定成分间分离良好，未有杂质干扰， 比较供试品溶液和对照品的母离子、子离子质谱图，两者一致，表明本法专属性良好。
[00巧]2.5线性试验 精密吸取"2.4"项下制备的混合对照品溶液适量，依次稀释，制得6个浓度的系列浓度 线性工作液，分别进样测定。W对照品浓度（C)为横坐标X，色谱峰面积与内标峰面积比值 (A/Ai)为纵坐标Y，进行线性回归，得回归方程见表2。
[0026] 表2 6种成分的线性关系
' 表2注:分析物1-6分别为东赏窘巧、1，3-0^二咖啡酷基奎宁酸、木犀草巧、3，4-0-二咖I 啡酷基奎宁酸、3，5-0-二咖啡酷基奎宁酸和4，5-0-二咖啡酷基奎宁酸 2 2.6重复性试验 取同批次羊耳菊药材，按"2. Γ项下方法平行制备6份供试品溶液，处理后分别进样测 定，根据内标法计算得^6平均含量分别为0.211、2.083，0.036，2.573、0.087和0.233 mg/ 邑，尺50分别为5.27%、4.24%、3.16%、1.51%、1.53%和2.96%，表明本方法重复性良好。
[0027] 2.7精密度试验 取与重复性一致的同一批号的供试品溶液，连续测定3 d，每天进样6次，依据内标法计 算含量，结果^6的日内及日间精密度(n=6)RSD分别为1.02 %~3.31 %和1.35 %~3.11 %，表 明仪器精密度良好。
[002引 2.8稳定性试验 取同一供试品溶液，分别处理后于0、2、4、8、12 h进样分析，1~6含量的RSD分别为1.94 %、1.54 %、3.49 %、1.87 %、2.83 %，5.79 %，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。
[00巧]2.9加样回收率试验 精密称取6份已知含量的羊耳菊样品适量，平均分为3组，分别精密加入0.5、1.0、2.0 mL混合对照品溶液（1 ~6浓度分别为0.042、0.130、0.063、0.210、0.126、0.134 mg/mL)，制成 低、中、高浓度的质控样品，按"2. Γ项下方法制备供试品溶液，按上述条件进样测定，计算 加样回收率，结果表3。
[0030] 表3回收率实验结果(％，n=3)
2.10样品测定 按"2. Γ项下方法制备6批样品的供试品溶液，处理后分别进样测定，根据内标法计算 样品中各成分的含量，结果见表4。
[0031] 表4 6批样品中6个成分的含量(mg/g, n=3)
3讨论 UPLC使用1.7皿颗粒度的色谱柱填料，能显著提高分离的效率，WLC-MS/MS法在不影 响分离效果的情况下大大提高了样品中各成分的分析速度。本研究首次建立了羊耳菊药材 的多指标成分含量测定方法，且采用UPLC-MS/MS法，在6 min内即可同时准确测定羊耳菊 中6个成分的含量，为羊耳菊的质量控制提供了一种快速灵敏、稳定可靠的新方法。
[0032] 实验中考察了 W甲醇、无水乙醇、25%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和水为提取 溶剂，分别用索氏提取、回流提取和超声处理，W及不同时间对羊耳菊进行提取，对测定结 果综合分析后，最后采用25%乙醇加热回流提取2 h，6种成分的提取效率较好。
[0033] 通过贵州不同产地的6批羊耳菊药材含量测定结果可W看出，羊耳菊中6种成分的 含量存在明显差异，其中贵州龙里产的药材含量较高，说明生态环境、采收时间和储存条件 等可能对含量产生影响。上述结果提示，为保证羊耳菊相关制剂批次间质量的一致性，应加 强羊耳菊的质量控制，必要时固定药材的来源。
【主权项】
1. 一种羊耳菊药材的多成分含量测定方法，其特征在于:所述方法包括采用超高效液 相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定羊耳菊药材中东莨菪苷、1，3-0-二咖啡酰基奎宁 酸、木犀草苷、3，4-0-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-0-二咖啡酰基奎宁酸、4，5-0-二咖啡酰基奎 宁酸6个成分的含量的步骤，在超高效液相色谱串联质谱分析中包括以葛根素为内标。2. 根据权利要求1所述的羊耳菊药材的多成分含量测定方法，其特征在于:在超高效液 相色谱串联质谱分析中采用Waters BEH C18(2.1 _X100 _，1.7 μπι)色谱柱。3. 根据权利要求1所述的羊耳菊药材的多成分含量测定方法，其特征在于:在超高效液 相色谱串联质谱分析中采用0.1%甲酸乙腈(A)-〇.l%甲酸水(Β)为流动相进行梯度洗脱。4. 根据权利要求3所述的羊耳菊药材的多成分含量测定方法，其特征在于:所述梯度洗 脱的程序如下：0~1.0 min，5%~15%(Α);1·0~3·8 min，15%~18%(Α);3·8~4.0 min，18%~90% (A)；4.0-5.0 min,90%~5%(A)〇5. 根据权利要求1所述的羊耳菊药材的多成分含量测定方法，其特征在于:在超高效液 相色谱串联质谱分析中包括还包括电喷雾电离源(ESI)，以多反应离子监测(MRM)检测的步 骤。6. 根据权利要求1所述的羊耳菊药材的多成分含量测定方法，其特征在于： 所述内标溶液的制备方法如下：精密称取葛根素，用甲醇定容，获得葛根素的储备液； 取内标储备液适量至容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成20 yg/mL的内标溶液，冷冻保存 备用。7. 根据权利要求5所述的羊耳菊药材的多成分含量测定方法，其特征在于： 所述电喷雾电离源(ESI)，以多反应离子监测(MRM)检测的步骤的质谱条件是:采用电 喷雾电离源(ESI)，毛细管电离电压3 kV，离子源温度120 °C ;去溶剂气犯，流速650 L/h， 去溶剂气温度350 °C，离子源温度120 °C ;碰撞气Ar，流速0.16 mL/min;扫描方式为多反 应离子监测(MRM)。8. 根据权利要求1-7中任一项所述的羊耳菊药材的多成分含量测定方法，其特征在于： 该方法还包括供试品溶液和对照品溶液的制备的步骤； 供试品溶液制备:取羊耳菊细粉约1. 〇〇〇〇g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入25%乙醇25 mL，称定重量(精确至0.01g)，加热回流提取2 h，放冷，再称定重量，用提取液补足减失的重 量，摇匀，过滤，精密吸取续滤液5 mL于蒸发皿，挥干溶剂;残余物转移至25 mL容量瓶，加甲 醇至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45 μπι)滤过，取续滤液，即得； 对照品溶液制备:分别精密称取东莨菪苷等6种对照品，各置10 mL容量瓶中，加甲醇定 容至刻度处，摇匀；得东莨菪苷(0·504 mg/mL)、1，3-0-二咖啡酰基奎宁酸（1 ·037 mg/mL)、 木犀草苷(0 · 856 mg/mL)、3，4-0-二咖啡酰基奎宁酸（1 · 007 mg/mL)、3，5-0-二咖啡酰基奎 宁酸(0.502 mg/mL)、4,5-0-二咖啡酰基奎宁酸（1.073 mg/mL)的储备液。
【专利摘要】本发明公开了一种羊耳菊药材的多成分含量测定方法，所述方法包括采用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）同时测定羊耳菊药材中东莨菪苷、1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草苷、3,4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸6个成分的含量的步骤，在超高效液相色谱串联质谱分析中以葛根素为内标。本发明首次建立了羊耳菊药材的多指标成分含量测定方法，且采用UPLC-MS/MS法，在6min内即可同时准确测定羊耳菊中6个成分的含量，为羊耳菊的质量控制提供了一种快速灵敏、稳定可靠的新方法。
【IPC分类】G01N30/88
【公开号】CN105628835
【申请号】CN201510576659
【发明人】兰燕宇, 黄勇, 李勇军, 王永林, 郑林, 王爱民, 廖尚高, 孙佳, 李月婷, 陈思颖, 陆苑, 巩仔鹏
【申请人】贵州医科大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2015年9月11日...