一种评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法，包括脂肪细胞诱导分化后用hoechst33258工作液对细胞核染色，测定吸光度值；胞核染色后用PBS清洗，用尼罗红工作液对胞内脂滴进行染色，测定吸光度值；定义一个新的用于评估脂肪细胞平均分化程度的数值：校正尼罗红OD值＝尼罗红OD值/hoechst33258的OD值，用于反应单位细胞分化程度；在荧光显微镜下对胞核和脂滴进行观察、拍照，并用Image?Pro Plus软件merge胞核和脂滴图片，用于评估脂肪细胞分化程度。本发明使用细胞总数对尼罗红OD值进行校正，消除由于细胞数目不同或细胞不均带来的误差；操作方法简单、准确度高、杂质少。
【专利说明】
一种评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种评估动物前体脂肪细胞分化程度的 检测方法。
【背景技术】
[0002] 研究动物前体脂肪细胞分化机制对于人类脂肪代谢紊乱性疾病治疗具有重要意 义。在体外，动物前脂肪细胞可以经鸡尾酒法(胰岛素、地塞米松、IBMX)诱导分化最终形成 成熟脂肪细胞，这一过程中，细胞胞质中甘油三脂不断合成并逐渐积聚形成圆形脂滴。通过 脂滴的数量和积聚程度可以评估前体脂肪细胞分化程度。目前，一般使用亲脂染料染色并 萃取检测吸光度的方法对成熟脂肪细胞中的脂滴进行定量和定性。油红〇可以将成熟脂肪 细胞中的脂滴染成红色，同时，用异丙醇萃取后检测吸光度可以对甘油三酯的多少进行量 化。因此，一直以来油红0染色被认为是一种经典的脂滴染色方法。但随着细胞实验技术的 快速发展，实验精度的要求也越来越高，经典的油红〇染色法也暴露出了自身的一些缺陷， 如:①染色时细胞需要固定和反复清洗，时间长且易破坏细胞层;②油红〇工作液在使用前 需要过滤，否则染色后会出现油红残渣，影响观察;③染色后不易将多余染液洗尽，导致异 丙醇萃取后检测出来的吸光度偏高；④饱和油红〇液体保存太久颜色会变得深黑，影响使 用;⑤在长时间操作过程中，挥发的异丙醇会影响实验者的健康。另外，用荧光染料尼罗红 染色检测吸光度值也可以用于定量脂滴的数量，相较油红〇萃取法更加方便可行。尼罗红或 油红0测定的吸光度值反应的是细胞总体的分化程度，适用于细胞数目相同的情况，然而实 际实验中，很难保证在分化成熟后不同实验组间细胞数目仍然相同，吸光度值高可能是分 化程度高，也可能是细胞数目多而分化程度一般，只能说明甘油三脂总体含量多。
[0003] 因此，仅仅通过吸光度值来判断细胞分化程度的高低是不够全面的。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法，旨在解 决通过吸光度值来判断细胞分化程度的高低是不够全面的问题。
[0005] 本发明是这样实现的，一种评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法，所述评 估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法定义用于评估脂肪细胞平均分化程度的数值:校 正尼罗红0D值=尼罗红0D值/hoechst33258的0D值，用于反应单位细胞分化程度。
[0006] 进一步，所述定义用于评估脂肪细胞平均分化程度的数值之前需要：
[0007] 步骤一，脂肪细胞诱导分化后用h〇eChst33258工作液对细胞核进行染色，并测定 吸光度值；
[0008] 步骤二，胞核染色后用PBS清洗，再用尼罗红工作液对胞内脂滴进行染色，并测定 吸光度值。
[0009] 进一步包括：
[0010] 第一步，前脂肪细胞分化，将孔板从培养箱取出，吸去培养液，PBS清洗两次；
[0011] 第二步，清洗后，每孔加入对应体积的h〇echst33258工作液，20-25°C避光孵育 lOmin；
[0012] 第三步，弃染液，用PBS轻缓清洗一次，将孔板置于荧光酶标仪中，设置激发波长/ 发射波长= 352nm/461nm，检测荧光强度；
[0013] 第四步，弃去染液并用PBS清洗两次，每孔加入对应量的PBS和尼罗红工作液，20-25°C避光孵育5min;
[0014] 第五步，将孔板置于荧光酶标仪中，设置激发波长/发射波长=485nm/572nm，检测 荧光强度；
[0015] 第六步，将孔板置于荧光显微镜，在同一视野下，用蓝色和红色光道对胞核和脂滴 进行观察并拍照。
[0016] 进一步，所述定义用于评估脂肪细胞平均分化程度的数值之后需要:在荧光显微 镜下对胞核和脂滴进行观察、拍照，并用Image-Pro Plus软件merge胞核和脂滴图片，用于 评估脂肪细胞分化程度。
[0017] 本发明提供的评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法，本发明定义一个新的 用于评估脂肪细胞分化程度的数值:校正尼罗红0D值=尼罗红0D值/hoechst 33258的0D 值。尼罗红0D值反应总的甘油三脂多少，Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光 染料，hoechst 33258的0D值反应细胞的数量。校正尼罗红0D值排除分化成熟后试验组间细 胞数目的差异，用于反应单位细胞分化程度。同时，使用Image-Pro Plus软件merge同一视 野的胞核和脂滴图片，比传统的油红〇染色图片更能够直观观察脂滴分布和细胞分布，并结 合校正尼罗红0D值来评估脂肪细胞分化程度。
[0018] 本发明操作方法简单、准确度高、简单易行、杂质少，更易于用户观察，可以在短时 间内对前体脂肪细胞分化程度进行精确评估。因此，此发明更适用于当前脂肪细胞分化的 工作。本发明提供一种快速精确评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法。该方法操作 简易、准确度高、耗时少、重复性好，能够有效反应脂肪细胞分化程度，为前体脂肪细胞分化 研究提供有效的检测方法。
[0019] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0020] 1)本发明使用hoechst33258染液。hoechst33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧 光染料，对细胞的毒性较低，可直接用于活细胞或组织的细胞核染色。比经典的苏木精染色 更加方便快捷，容易操作，且杂质少，便于观察。同时用hoechst33258染色后可以测定吸光 度值，直接反应细胞数目。
[0021] 2)本发明使用尼罗红工作液对脂滴进行染色。与经典的油红0染色法相比，尼罗红 染色不用固定细胞、且杂质少、染色时间短，同时使用尼罗红的0D值可以避免油红0萃取法 未清洗干净或萃取不够带来的假阳性和假阴性结果，方便快捷，准确度较高。
[0022] 3)本发明定义一个新的用于评估脂肪细胞平均分化程度的数值:校正尼罗红0D值 =尼罗红0D值/hoechst33258的0D值。尼罗红0D值反应总的甘油三脂多少，Hoechst33258 是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，hoechst 33258的0D值反应细胞的数量。校正尼罗 红0D值排除分化成熟后试验组间细胞数目的差异，用于反应单位细胞分化程度。与传统的 油红0萃取法和测定总尼罗红0D值法相比，使用hoechst33258的0D值校正可以排除分化后 细胞数目的差异，避免假阴性和假阳性的干扰，更能够客观反应脂肪细胞真实的分化程度。
[0023] 4)本发明使用Image-Pro Plus软件merge同一视野的胞核和脂滴图片，比传统的 油红0染色图片更能够直观观察脂滴分布和细胞分布。
【附图说明】
[0024] 图1是本发明实施例提供的评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法流程图。
[0025] 图2是本发明实施例提供的不同时间点3T3-L1诱导分化尼罗红0D值示意图。
[0026]图3是本发明实施例提供的不同时间点3T3-L1诱导分化校正尼罗红0D值示意图。
【具体实施方式】
[0027] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0028] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0029] 如图1所示，本发明实施例的评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法包括以 下步骤：
[0030] S101:前脂肪细胞分化到实验所需的时间点后，将孔板取出培养箱，小心吸去培养 液，PBS清洗两次，注意不要损坏底层细胞；
[0031] S102:清洗后，每孔加入相应体积的hoechst33258工作液(见表1)，室温(20-25°C) 避光孵育5min;
[0032] S103:弃染液，用PBS轻缓清洗一次，将孔板置于荧光酶标仪中，设置激发波长/发 射波长= 352nm/461nm，检测荧光强度；
[0033] S104:弃去多余染液并用roS轻缓清洗两次，每孔加入对应量的roS和尼罗红工作 液(见表1)，室温(20-25°C)避光孵育5min;
[0034] S105:将孔板置于荧光酶标仪中，设置激发波长/发射波长= 485nm/572nm，检测荧 光强度；
[0035] S106:将孔板置于荧光显微镜下，在同一视野下，用蓝色和红色光道对胞核和脂滴 进行观察并拍照；
[0036] S107:定义一个新的用于评估脂肪细胞平均分化程度的数值:校正尼罗红0D值= 尼罗红0D值/hoechst33258的0D值，用于反应不同实验组之间单位细胞分化程度；
[0037] S108:使用Image-Pro Plus软件merge胞核和脂滴图片，并结合校正尼罗红0D值来 评估脂肪细胞分化程度。
[0038]表1.孔板对应试剂添加量
[0040]下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
[0041 ] 实施例1:
[0042]用鸡尾酒法诱导小鼠前体脂肪细胞系3T3-L1，诱导分化后2、4、6、8、10天用于实 验，用h〇echst33258和尼罗红染色，并分别检测其吸光度值。详细步骤如下：
[0043]步骤1: 3T3-L1于96孔板中诱导分化到时间点，从培养箱中取出孔板，小心吸去培 养液，注意枪头不要触及底层细胞；
[0044] 步骤2:roS清洗两次（200ul/孔），动作尽量轻缓，清洗后，每孔加入h〇echst33258 工作液，室温(20-25°〇避光孵育511^11;
[0045]步骤3:弃染液，用PBS轻缓清洗一次，将孔板置于荧光酶标仪中，设置激发波长/发 射波长=352nm/461nm，检测荧光强度。
[0046] 步骤4:弃去染液并用roS清洗两次，每孔加入200ulPBS，加入5ul尼罗红工作液，室 温（20-25°〇避光孵育511^11;
[0047]步骤5:孔板置于荧光酶标仪中，设置485nm/572nm波长检测荧光强度;并计算校正 尼罗红0D值；
[0048] 步骤6:将孔板置于荧光显微镜，在同一视野下，用蓝色和红色光道对胞核和脂滴 进行观察并拍照。
[0049] 从如图3的结果中，可以清晰地观察到各个时间点3T3-L1诱导分化脂滴分布及细 胞密度分布，从merge以后的图片中观察更加直观。诱导分化6天、8天、10天，3T3-L1细胞中 脂滴呈现增长趋势。检测吸光度后可见，总尼罗红0D值在第2天比第4天高，第8天比第10天 高，而校正后尼罗红0D值可见，第2天比第4天低，第8天比第10天低，细胞平均分化程度随时 间均匀平缓增加，更加符合前体脂肪细胞分化规律，而仅仅通过尼罗红0D值则不能全面反 应细胞分化程度，因为在细胞分化后每个孔之间会存在生长速度不同，营养供给差异，细胞 状态也不一样，因此，通过校正尼罗红0D值可以规避掉这一缺陷，消除由于细胞数目不同或 细胞不均带来的误差。本发明操作方法简单、准确度高、简单易行、杂质少，更易于用户观 察，可以在短时间内对前体脂肪细胞平均分化程度进行精确评估。因此，本发明更适用于当 前脂肪细胞分化的研究工作。
[0050] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法，其特征在于，所述评估动物前体 脂肪细胞分化程度的检测方法定义用于评估脂肪细胞平均分化程度的数值:校正尼罗红0D 值=尼罗红0D值/hoechst33258的0D值，用于反应单位细胞分化程度。2. 如权利要求1所述的评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法，其特征在于，所述 定义用于评估脂肪细胞平均分化程度的数值之前需要： 步骤一，脂肪细胞诱导分化后用h〇echst33258工作液对细胞核进行染色，并测定吸光 度值； 步骤二，胞核染色后用PBS清洗，再用尼罗红工作液对胞内脂滴进行染色，并测定吸光 度值。3. 如权利要求2所述的评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法，其特征在于，进一 步包括： 第一步，前脂肪细胞分化，将孔板从培养箱取出，吸去培养液，PBS清洗两次； 第二步，清洗后，每孔加入对应体积的h〇echst33258工作液，20-25°C避光孵育lOmin; 第三步，弃染液，用PBS轻缓清洗一次，将孔板置于荧光酶标仪中，设置激发波长/发射 波长= 352nm/461nm，检测荧光强度； 第四步，弃去染液并用PBS清洗两次，每孔加入对应量的roS和尼罗红工作液，20-25°C 避光孵育5min; 第五步，将孔板置于荧光酶标仪中，设置激发波长/发射波长= 485nm/572nm，检测荧光 强度； 第六步，将孔板置于荧光显微镜，在同一视野下，用蓝色和红色光道对胞核和脂滴进行 观察并拍照。4. 如权利要求1所述的评估动物前体脂肪细胞分化程度的检测方法，其特征在于，所述 定义用于评估脂肪细胞平均分化程度的数值之后需要:在荧光显微镜下对胞核和脂滴进行 观察、拍照，并用Image-Pro Plus软件merge胞核和脂滴图片，用于评估脂肪细胞分化程度。
【文档编号】G01N15/10GK106092862SQ201610398881
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】张进威, 马继登, 李明洲, 李学伟, 龙科任
【申请人】四川农业大学