一种荧光显微图像二值化的自适应阈值方法与流程

本发明涉及显微镜系统的图像处理领域，特别是一种荧光显微图像二值化的自适应阈值方法。

背景技术：

荧光显微成像技术是生物医学、细胞与分子生物学、微生物学、环境科学等领域的重要研究手段之一。

在图像处理中，二值化是主要处理手段之一，对灰度图像进行二值化的基本思想是确定一个阈值，然后把每个像素点的灰度值和阈值比较，根据比较的结果把图像中各像素划分为目标和背景两类。对于光照均匀的图片，应用经典的全局阈值方法可以取得较好的效果，这些方法包括:根据直方图双峰间谷底阈值法、迭代选择阈值法、最大类间方差法(OSTU)法等。对荧光显微图像，特点包括：具有弱背景光，目标物具有相对强的荧光；背景光照不均匀，特别在高倍率物镜下，中间与四周背景存在明显亮度差；当目标物较少时(如微生物显微成像)，直方图不存在明显的峰值，多数像素属于低灰度值；可能同时存在多色的荧光成像信号，对目标颜色的荧光目标的二值化处理造成干扰；荧光显微成像质量不一等。对于荧光显微图像，常用的全局化的阈值方法存在应用上存在着实际的困难，双峰法对于直方图无峰的荧光图像无法使用，OSTU法、迭代法等对背景和目标比较接近的低信噪比图像处理失效。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于克服现有技术中的上述缺陷，提出一种能有效、快速地进行二值化处理的荧光显微图像二值化的自适应阈值方法。

本发明采用如下技术方案：

一种荧光显微图像二值化的自适应阈值方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)分别提取荧光显微图像的RGB三个颜色通道，生成三个灰度图像，并分别滤除这三个灰度图像的低频背景部分；

2)计算滤波后灰度图像分布直方图，获得低灰度区的最高值，去除最高值之前的数据点，生成新的维点曲线并进行归一化处理；

3)对归一化后的维点曲线进行双段指数函数拟合，根据统计判断参数对拟合值进行判断是否需要阈值计算，若是则根据双段指数函数计算阈值。

4)根据阈值对归一化后的维点曲线再做二值化处理，生成矩阵A；

5)将1)中的荧光显微图像RGB格式转换为HSV格式，根据HSV矩阵中色度值分别判断每像素颜色，生成目标颜色的逻辑矩阵B；

6)在目标颜色类型中，对矩阵A和矩阵B进行逻辑和运算，获得该颜色的二值化图。

优选的，在步骤2)中采用形态学Tophat滤波滤除低频背景部分。

优选的，在步骤3)中，所述的根据双段指数函数计算阈值，是指对双段指数函数求导，获得曲线转折点，以该转折点的横坐标值乘以255倍作为阈值。

由上述对本发明的描述可知，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明的二值化方法，能够对低信噪比的多颜色荧光显微图像，获得不同颜色的二值化结果，方便后续图像的处理。

2、本发明的二值化方法，对灰度图像进行低频背景的滤波以消除光照不匀的背景，适用于荧光显微成像中间亮度高、四周亮度低，背景亮度变化为低频的特点。

3、本发明的二值化方法，对直方图做归一化处理的理由是消除直方图纵坐标、横坐标由于物理意义不同引发的差异性。

4、本发明的二值化方法，去除直方图中低灰度值区峰值前区域的理由是将背景黑化，适用于递减类型函数拟合。

5、本发明的二值化方法，采用统计判断拟合结果，以判断是否需要阈值计算，荧光显微图像通道，存在无目标或目标像素极少的情况，通过统计判断以避免错误阈值计算。

6、本发明的二值化方法，将图像数据转换成HSV格式，获得多于三个通道的颜色判断，更符合荧光显微镜实际荧光通道设置情况。

附图说明

图1为原始图像。

图2(a)-图2(c)为经过形态学Tophat滤波后的RBG三通道图像。

图3为蓝色通道原始直方图。

图4为归一化处理后直方曲线拟合曲线图。

图5为未经颜色校正计算处理后的二值化结果。

图6为经本发明方法计算处理后的二值化结果。

图7为采用OTSU方法的二值化结果图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明作进一步的描述。

一种荧光显微图像二值化的自适应阈值方法，包括如下步骤：

1)分别提取荧光显微图像的RGB三个颜色通道，生成三个灰度图像，并采用形态学Tophat滤波分别滤除这三个灰度图像的低频背景部分，实现每个颜色通道的灰度图像背景均一化。该步骤能消除光照不匀的背景，适用于荧光显微成像中间亮度高、四周亮度低，背景亮度变化为低频的特点。

2)计算滤波后灰度图像分布直方图，获得低灰度区的最高值(i代表灰度值)，去除最高值之前的数据点，生成新的维点曲线并进行归一化处理；对直方图做归一化处理的理由是消除直方图纵坐标、横坐标由于物理意义不同引发的差异性。去除直方图中低灰度值区峰值前区域的理由是将背景黑化，适用于递减类型函数拟合。

3)对归一化后的维点曲线进行双段指数函数拟合(a×exp(b×x)+c×exp(d×x)，a、b、c、d为双段指数函数常数)，根据统计参数对拟合值进行判断是否需要阈值计算(例如拟合度判定系数R²>0.95)，若是则对双段指数函数求导，获得曲线转折点，以该转折点的横坐标值乘以255倍作为阈值。若否，则则表明该图并非弱背景光的荧光图像(如明视野图像)，并不适合本方法进行计算。若是明视野或目标物过大等高背景图像，则拟合度判定系数R²值较低，通过统计判断以确定图像是否适用于本方法计算，避免错误阈值计算。

4)根据阈值对归一化后的维点曲线再做二值化处理，生成矩阵A；

5)1)中的荧光显微图像RGB格式转换为HSV格式，根据HSV矩阵中色度(Hue)值分别判断每像素颜色，生成目标颜色的逻辑矩阵B。将RGB图像数据转换成HSV格式，可以获得多于三个通道的颜色判断，更符合荧光显微镜实际荧光通道设置情况；

6)在预设颜色类型中，对矩阵A和矩阵B进行逻辑和运算，获得该颜色的二值化图。

应用举例

以土壤样品中细菌荧光显微成像图处理的二值化过程为例。在土壤样品中，细菌荧光显微成像图通常存在复杂的背景荧光信息,其二值化处理通常需要针对每一个图像根据成像的质量进行人工调整，在实际应用中存在适应性的问题，无法自动化或批量处理图片。在本例中，土壤样品以DAPI染色以计数微生物数量，由于样品中存在大量矿物质与有机物，产生干扰荧光。

通过本发明方法对土壤样品中细菌荧光显微成像图的二值化处理：

1)分别提取荧光显微图像(图1)的三个颜色通道生成三个灰度图像(图2(a)-图2(c))，采用形态学Tophat滤波滤除低频背景部分，实现每个颜色通道灰度图像背景均一化。

2)计算待处理灰度图像分布直方图(图3)；获得低灰度值区的最高值(去除最高值之前数据点；生成新的二维点曲线并进行归一化处理(图4)。

3)对上述二维点曲线进行双段指数函数拟合，获得拟合曲线(f(x)＝0.5209×exp(-9.402×x)+0.7232×exp(-0.7892×x))(图4)；根据拟合曲线的拟合度判定参数(R²＝0.9889，>0.95)判断得到拟合结果符合计算需求；则对上述双段指数函数求导(f(x)′＝diff(f(x))＝-0.5707×exp(-0.7892×x)-4.8975×exp(-9.402×x))；获得曲线转折点(f(x)′＝-1))，以转折点的横坐标值乘以255倍即为灰度阈值(x＝107)；

4)根据上述阈值再做二值化处理获得RGB图像的蓝色通道二值化图(矩阵A)(图5)。

5)将目标图像由RGB转换成HSV格式，根据HSV矩阵的色度值(Hue)判断每像素颜色；生成蓝色的逻辑矩阵

6)对蓝色的逻辑矩阵和RBG图像的蓝色通道的二值化矩阵进行逻辑和运算(A&B)，获得该颜色的二值化图(图6)。

7)应用常用的OSTU阀值算法，对RGB图像的蓝色通道进行计算，二值化处理后获得二值化图(图7)，对土壤样品微生物数量以及细胞大小计算有严重的误差。

上述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。