一种中药对复杂性疾病所致“失和”网络整合调节作用的定量评价方法与流程

本发明涉及中药药理学领域，尤其涉及一种中药对复杂性疾病所致“失和”网络整合调节作用的定量评价方法。

背景技术：

中医药是中华民族数千年来在生活实践和与疾病斗争的过程中积累的瑰宝，是在几千年临床实践中逐步发展而成的医学科学，直至今日仍在国民健康事业中具有举足轻重的作用，同时也为全人类的健康做出了重要贡献。

现代研究表明，中药中多种药效成分通过协调互济作用从整体水平调节机体状态，具有“多成分、多靶点、多途径”的整合调节作用，在治疗复杂性疾病方面具有不可替代的优势。

中药通过其化学物质组成与机体生命系统的相互作用发挥药效作用，因此，中药化学物质成分辨识、药效药理作用研究以及成分与生物效应之间的相关性辨识等成为了研究中药配伍科学内涵的关键环节。

目前，国内外对中药配伍规律的研究主要集中在其具体内涵的理论研究和应用现代实验手段揭示其配伍原理等方面。其中，文献研究着重于文献的整理和知识挖掘，主要有基于频次统计和关联规则、基于复杂系统熵聚类、基于人工神经网络等方法；而实验研究主要以中药化学成分辨识、中药生物学效应或化学成分与生物效应之间的交互作用为切入点来探讨中药的配伍规律及其科学内涵。

例如：(1)丁选胜等(丁选胜，安娜芹，姚丹，赵一鸣.人参白虎汤不同配伍条件下人参皂苷rg1和re变化的研究.中草药2007,no.421(05):702-704.)通过hplc法测定不同配比的人参白虎汤中人参皂苷re和rg1的含量变化情况，探讨人参白虎汤的配伍规律，结果发现人参配伍方剂中其他药材后，一定程度增加了re和rg1的溶出量，证明了人参白虎汤配伍比例的合理性。

(2)商洪才等(商洪才，张伯礼，高秀梅，王怡，李玉红，康立源，杜嵘，江海涛.丹参三七药对不同配比药效学比较研究.辽宁中医杂志2002(05):297-299.)采用冠状动脉左前降支结扎法构建犬急性心肌缺血模型，观察不同比例丹参-三七配伍后的药效，结果表明丹参、三七配伍后药效作用强于各单味药材的药效，且以10:6和10:3配伍的丹参-三七药效最突出。

(3)刘慧兰等(刘慧兰，欧阳建军.桂枝、柴胡与白芍分别配伍的相关药效学研究.湖南中医药大学学报2007,no.127(03):31-33.)研究了桂枝、柴胡与白芍分别配伍后的作用，结果表明柴胡和白芍配伍后具有解痉和镇痛作用；桂枝和白芍配伍后具有抗炎和镇痛作用，且在镇痛方面具有协同效应。

(4)刘明平等(刘明平，林铿，黄兆胜，吴庆光.通脉复方有效组分抑制肾小球系膜细胞增殖的活性筛选及配伍研究.中国实验方剂学杂志2011,v.17(08):172-175.)通过考察通脉复方(黄芪和三七)组成中有效组分对肾小球系膜细胞增殖的影响，发现总多糖和总皂苷是通脉复方中的主要有效成分，且4:1为最佳的剂量配比。

(5)吕琳星等(吕琳星，范雪梅，梁琼麟，王文凯，王义明，罗国安.基因芯片用于组分中药新双龙方的配伍机制研究.高等学校化学学报2012,v.33(11):2397-2404.)采用基因芯片技术研究新双龙方剂及其有效组分(人参总皂苷和丹参总酚酸)治疗急性心肌梗塞大鼠的作用机制，研究结果发现新双龙方组能比有效组分组更积极的调控相关的靶基因，且新双龙方能富集到更多的通路，从而证实了新双龙方的配伍优势。

随着网络药理学的兴起，基于中药网络药理学的方剂配伍规律研究也拉开了帷幕，并取得了一定的进展。

吴磊宏等(wul,wangy,liz,zhangb,chengy,fanx.identifyingrolesof“jun-chen-zuo-shi”componentherbsofqishenyiqiformulaintreatingacutemyocardialischemiabynetworkpharmacology.chinesemedicine2014,9(1):1-9.)通过基于网络药理学的方法探讨芪参益气方治疗急性心肌缺血的药理作用，从分子网络和通路水平解释了方剂中药材“君臣佐使”的配伍原则。任钧国等(任钧国，马晓斌，林成仁，李鸿海，王敏，李军梅，王杨慧，刘建勋.基于网络方法的中药方剂药理作用配伍规律分析.中国中药杂志2010,v.35(18):2469-2474.)以加味生脉散为研究对象，构建基于网络的中药方剂药理作用配伍网络，研究了其抗大鼠急性心肌缺血-再灌注损伤作用的配伍规律。li等(lix,xux,wangj,yuh,wangx,yangh,xuh,tangs,liy,yangl.asystem-levelinvestigationintothemechanismsofchinesetraditionalmedicine:compounddanshenformulaforcardiovasculardiseasetreatment.plosone2012,7(9):e43918.)提出了基于化学成分、化学基因组学和药理学数据的网络方法系统的探究了复方丹参方治疗心血管疾病的药理作用机制，并阐明了方剂中丹参是君药、三七是臣药、冰片是佐药的配伍原则。

虽然已有大量关于中药配伍规律的研究，并在一批中药的配伍规律研究上取得了良好进展，但相关研究多以还原论思维模式开展，从单一的药效指标或物质基础角度分析中药配伍规律，这与中药的整体性原则存在分歧，且往往与病证脱节、缺乏传统理论依据，与临床实际应用仍有距离。导致这一局面的主要原因是，中药配伍规律研究仍存在以下瓶颈问题尚未突破：1)中药数量庞大且绝大部分由古人所留下，其配伍规律及科学内涵的描述和记载与现代医学体系分属两套不同的描述符号系统，难以被理解与接受。2)大部分的中药，尤其是方剂，均由两味以上的药材组成，化学成分复杂，且成分间存在相互作用，加大了中药配伍规律研究的难度。3)中药通过作用于机体的特定证候而发挥作用，而生命机体高度复杂，且中医证候现代化研究相对匮乏，严重阻碍了中药配伍规律及其科学内涵的深入研究。

因此，面对如此庞大的中药数量，面临着中药化学组成和机体生命系统的双重复杂性，亟需拓宽思路，引入现代技术手段对宏观理念和微观事实进行有机衔接，以期揭示中药配伍的科学内涵。

技术实现要素：

本发明提供了一种中药对复杂性疾病所致“失和”网络整合调节作用的定量评价方法，该方法结合中药中入血成分与靶蛋白的对接得分值和成分在中药中的相对含量，有效辨识中药化学组成与机体生物分子网络之间的相关性，定量描述中药对其相关“失和”生物分子网络的调控力度(即中药对复杂性疾病所致“失和”网络的整合调节作用)。

一种中药对复杂性疾病所致“失和”网络整合调节作用的定量评价方法，包括以下步骤：

(1)获取中药对复杂性疾病的潜在作用靶点，利用所述潜在作用靶点构建所述“失和”生物分子网络；

(2)计算获得中药对所述“失和”生物分子网络的调控力度值；

a)利用所述中药中入血成分与所述“失和”生物分子网络中靶蛋白的对接得分值，计算所述“失和”生物分子网络中各连接的权重；

式(1)中，scomp表示中药中入血成分与网络中蛋白进行分子对接的得分值；sreference表示网络中蛋白质复合结构的原始配体与蛋白进行分子对接的最低得分值；ew表示网络中的任何一个节点到下游直接节点的连接的权重；

b)将所述权重代入式(2)和式(3)中，计算获得网络效能和网络流；

式(2)中，dwij为网络中节点i与节点j之间的最短距离，即节点i到节点j之间所经过的边的权重之和最小；n为网络中所有节点的集合，ne为网络效能，即网络中任何一个节点i到下游节点j的最短路径的倒数和；

式(3)中，dwim为网络中节点i与节点之间的最短距离，即节点i到节点m之间所经过的边的权重之和最小；n为网络中所有节点的集合，nf为网络流，即网络中任何一个节点i到网络中叶节点m的最短路径的倒数和；leafnode表示叶节点，是指网络中出度为0的节点；

c)将所述网络效能和网络流代入式(4)中，计算获得中药中入血成分对所述“失和”生物分子网络的调控能力；

式(4)中，当所述“失和”生物分子网络中所有连接的权重均为初始值1时，计算得到nemax和nfmax；necomp表示中药中单个入血成分对所述“失和”生物分子网络的网络效能，nfcomp表示中药中单个入血成分对所述“失和”生物分子网络的网络流；re表示中药中入血成分对所述“失和”生物分子网络的调控能力；

d)将所述“失和”生物分子网络的调控能力代入式(5)中，计算得到中药对复杂性疾病所致“失和”生物分子网络的调控力度值；

式(5)中，k表示中药中的入血成分，g表示中药中所有入血成分的集合，ak表示成分k在中药所有入血成分中所占的峰面积百分比，fre表示中药对复杂性疾病所致“失和”生物分子网络的调控力度值；

(3)比较不同中药之间的调控力度值，评价各中药对所述“失和”生物分子网络的调控能力。

本发明方法中的分子对接是应用molecularoperatingenvironment(moe，v2014.09)的分子对接模块完成蛋白质和化合物的分子对接工作；其主要流程包括蛋白结构矫正(structurepreparation)、质子化(protonate3d)、配体构象优化和应用打分函数进行评分等。

本发明结合入血成分在lc-ms分析中的相对含量设计了用于评价中药对网络调控能力的方法。网络中的任何一个节点(i)到下游直接节点(j)的连接权重根据公式(1)计算得到；设定网络中所有连接的初始权重为1，最大权重为200。每一个网络中蛋白质复合结构中的原始配体与该蛋白进行分子对接模拟，选取最低得分值作为该网络的sreference，scomp为化合物与网络中蛋白进行分子对接的得分值。根据网络中连接权重的不同，按照公式(2)计算网络效能，其中dwij为网络中任意两节点间具有最小值的最短距离，n为网络中所有节点的集合。在有向网络中，下游蛋白对网络功能具有更重要的调控作用，因此引入网络流权衡网络中不同节点的重要程度。

进一步地，所述中药为四逆汤类方。

更优选，所述中药为四逆汤、四逆加人参汤、茯苓四逆汤、通脉四逆汤或通脉四逆加猪胆汁汤。

进一步地，所述复杂性疾病为心脑血管疾病。

更优选，所述复杂性疾病为急性心肌梗塞。

进一步地，步骤(1)中，获取所述潜在作用靶点的方法，包括以下步骤：

a)获得中药作用于复杂性疾病的芯片数据；

b)采用cmap法得到中药作用复杂性疾病的潜在相关靶蛋白；

c)采用eor法得到中药作用复杂性疾病的潜在相关基因；

d)整合所述潜在相关靶蛋白和潜在相关基因，得到中药作用复杂性疾病的潜在作用靶点。

进一步地，所述cmap法，包括以下步骤：

(a)计算探针的fc值，当探针的fc绝对值大于1.2，且p<0.05时，定义为显著差异表达的探针；

(b)根据探针改变的幅度大小，挑选中药芯片数据中上调或下调幅度最大的显著差异表达的探针与cmap数据库中的芯片数据进行相似度匹配，找到与中药相关性最强的化合物；

(c)根据stitch4.0数据库中化合物-蛋白质相互作用的数据信息，得到潜在作用蛋白靶点。

fc(foldchange)值，即fc(sns/model)值，是指中药给药组(sns)与模型对照组(model)基因转录水平表达强度的比值。

进一步地，所述eor法，包括以下步骤：

a)根据芯片数据计算节点的回调状态；

式(6)中，rl′表示回调状态；loge为各组的基因表达水平取log2对数后的均值；edrug为中药给药组的芯片数据；esham为假手术组的芯片数据；emodel为模型对照组的芯片数据。

b)计算节点的回复调控效率

eor＝100％-|100％-rl′|(7)

式(7)中，eor表示为回复调控效率，是用于表征节点回调效率的指标；rl′表示回调状态；eor值大于0的节点为所述潜在相关基因。

进一步地，所述“失和”生物分子网络的构建，包括以下步骤：

a)应用davidbioinformaticsresources6.7软件对靶点列表进行通路富集分析，找到所述复杂性疾病相关的生物学信号通路，定义p<0.05为显著富集通路；

b)以kegg数据库中显著富集的通路为基础，构建所述“失和”生物分子网络。

进一步地，所述通路为calciumsignalingpathway(钙离子信号通路)、erbbsignalingpathway(erbb信号通路)、vascularsmoothmusclecontraction(血管平滑肌收缩通路)、insulinsignalingpathway(胰岛素信号通路)和steroidhormonebiosynthesis(类固醇激素的生物合成)。

所述“失和”生物分子网络为钙离子稳态相关“失和”网络(net.calcium)、血管新生相关“失和”网络(net.angiogenesis)、血管平滑肌收缩相关“失和”网络(net.vsmcontraction)、能量代谢相关“失和”网络(net.energymetabolism)或类固醇激素合成相关“失和”网络(net.steroid)。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明方法结合中药中入血成分与靶蛋白的对接得分值和成分在中药中的相对含量，有效辨识中药化学组成与机体生物分子网络之间的相关性，定量描述中药对其相关“失和”生物分子网络的调控力度。

(2)本发明以一系列中药(如类方)为载体，在系统剖析各中药化学组成及生物学效应的基础上，通过比较各中药之间的内在异同，探讨诠释中药的配伍科学内涵，丰富和拓展了中药配伍规律的研究思路。

附图说明

图1为本发明中药对复杂性疾病所致的“失和”生物分子网络调控能力的评价方法的流程图。

图2为四逆汤类方给药对大鼠心肌梗死范围的影响；

(a)ttc染色法评价心肌梗死面积的统计结果。其中model、sin和rsin，n＝6；fsin、tsin和zsin，n＝7；^**代表与模型对照组相比p<0.01；

(b)心肌梗死大鼠的代表性心脏切片图，正常心肌呈红色，梗死心肌呈白色；其中sham为假手术组大鼠的心脏切片图。

图3为本发明方法获得的四逆汤类方相关的急性心肌梗塞所致的“失和”生物分子网络；

其中，(1)能量代谢相关“失和”网络(net.energymetabolism)；(2)血管新生相关“失和”网络(net.angiogenesis)；(3)血管平滑肌收缩相关“失和”网络(net.vsmcontraction)；(4)钙离子稳态相关“失和”网络(net.calcium)；(5)类固醇激素合成相关“失和”网络(net.steroid)。

图4为四逆汤类方对急性心肌梗塞所致的相关“失和”生物分子网络的调控差异；

其中，sin为四逆汤组；rsin为四逆加人参汤组；fsin为茯苓四逆汤组；tsin为通脉四逆汤组；zsin通脉四逆加猪胆汁汤组；

net.energymetabolism为能量代谢相关“失和”网络；net.angiogenesis为血管新生相关“失和”网络；net.vsmcontraction为血管平滑肌收缩相关“失和”网络；net.calcium为钙离子稳态相关“失和”网络；net.steroid为类固醇激素合成相关“失和”网络。

图5为四逆汤类方对血管缺失模型斑马鱼的影响；

其中，正常对照组：control；模型对照组：model；阳性药对照组(30μm)：ast；(a)四逆汤类方对血管缺失斑马鱼肠下血管面积影响的表型图；虚线区域为肠下血管面积；(b)四逆汤类方对血管缺失斑马鱼肠下血管分支数影响的表型图；白色箭头所指为肠下血管分支数；(c)四逆汤类方对血管缺失模型斑马鱼肠下血管面积的保护率。

图6为四逆汤类方对心衰斑马鱼的影响；

其中，正常对照组：control；模型对照组：model；阳性药对照组(0.1μg/ml)：digoxin；(a)四逆汤类方对心衰斑马鱼心脏静脉淤血改善表型图；白色箭头所指为静脉淤血处；(b)四逆汤类方对心衰斑马鱼心脏静脉淤血的保护率；(c)四逆汤类方对心衰斑马鱼血流速度的保护率。

具体实施方式

一种中药对复杂性疾病所致“失和”网络整合调节作用的定量评价方法，具体步骤如下：

(1)获取中药对复杂性疾病的潜在作用靶点，利用所述潜在作用靶点构建所述“失和”生物分子网络；

a)获得中药作用于复杂性疾病的芯片数据。

以大鼠为研究对象，构建大鼠的急性心肌梗塞模型，对患有急性心肌梗塞的大鼠实施灌胃给药(即中药)进行疾病的治疗，取大鼠的心肌组织用于基因芯片检测，获得芯片数据。

①实验组别及剂量设置

根据《伤寒论》中人的日给药量换算得到动物实验中大鼠的日给药量，四逆汤类方粉末，包括四逆汤、四逆加人参汤、茯苓四逆汤、通脉四逆汤和通脉四逆加猪胆汁汤均自制。深黄色粉末，常温干燥保存，临用前方剂称重，加适量milli-q水溶解、混匀并定容至方剂的给药体积。

设置实验的组别，分为假手术组sham(构建急性心肌梗塞模型时，大鼠只穿线不结扎；不进行给药，给予相应量的milli-q水)、模型对照组model(构建急性心肌梗塞模型时，大鼠结扎；不进行给药，给予相应量的milli-q水)、中药给药组sns(构建急性心肌梗塞模型时，大鼠结扎；进行给药)。

②大鼠急性心肌梗塞模型的制备

sd大鼠，禁食过夜，自由饮水。实验当天腹腔注射360mg/kg水合氯醛麻醉，每只肌注0.1ml盐酸利多卡因抗心律失常。开胸前连接alc-v8呼吸机，开胸后迅速于大鼠左侧第三和第四肋间小心掏出心脏，并用6/0线结扎冠状动脉左前降支。结扎后小心地将心脏放回胸腔，排尽胸腔内空气，用4/0线缝合肌肉组织和皮肤。每只大鼠肌肉注射青霉素16万单位。手术后第二天，通过眼眶取血方法对手术后存活的大鼠进行采血，血液室温静置30min后，4℃下4000rpm/min离心15min，取上清测定大鼠血清中心肌肌钙蛋白t(ctnt)的浓度。根据ctnt浓度判断大鼠急性心肌梗塞模型的成功与否。

ttc用心肌组织取材：sd大鼠称重，腹腔注射360mg/kg水合氯醛麻醉后，腹主动脉取血后，用20ml预冷的生理盐水对心脏进行灌流后，剪下心脏于预冷的生理盐水中清洗。剔除结缔组织和右心室等后取结扎线以下的部位置于预冷的2ml冻存管中，再-80℃贮存备用。

基因芯片检测用心肌组织取材：所用手术器械使用之前首先用含有0.1％depc水处理，再进行高压灭菌并烘干。用20ml预冷的含0.1％depc生理盐水对心肌进行灌流后，剪下心脏置于预冷的含0.1％depc生理盐水中清洗，并剔除结缔组织和右心室等。取结扎线以下梗死和正常心肌交界区的心肌组织两份，每份约150mg，用铝箔纸包装后分别置于预冷的2ml冻存管中，迅速于液氮中冻存，之后再-80℃贮存备用。

③基因芯片实验及数据预处理

采用的芯片为affymetrixratgenome2302.0array，该芯片平台为大鼠全基因组芯片。应用mirvana^tmrnaisolationkit(appliedbiosystemp/nam1556)试剂盒提取心肌样品的总rna。利用nanodropnd-2100对样品总rna进行定量并采用agilentbioanalyzer2100检测rna完整性。

质检合格后，采用affymetrix表达谱芯片配套试剂盒，参照标准操作流程进行样本标记、芯片的杂交以及洗脱等。经affymetrixscanner3000扫描得到原始图像并利用agcc软件(affymetrixgenechipcommandconsoleversion4.0)提取得到原始数据(.cel格式)。原始数据导入arraytrack软件中，应用mas5算法进行背景校正，再对所有数据进行中位数1000的标准化处理，方便后续芯片之间的比较研究。

④基因芯片实验结果验证

对同一批rna样本，采用实时定量pcr(real-timequantitativepcr)实验验证芯片数据结果的可靠性。txn2、pkp2、cxcl12、cacnb2和gapdh的引物由上海祥音生物科技有限公司合成，其中gapdh为内参基因。

实时定量pcr验证实验过程分为3个步骤。

1)rna逆转录合成cdna。采用ambion动物试剂盒抽提大鼠心脏组织中rna。样品中rna浓度采用nanodrop2000spectrophotometer进行测定，再按照逆转录试剂盒的标准操作流程逆转录合成cdna。

2)样品实时定量pcr测定。引物经适量depc水溶解后得到100μm的引物储备液，再根据quantifastsybrgreenpcrkit试剂盒的标准操作流程进行样品的实时定量pcr检测。

3)应用2^-δδct方法计算基因转录水平表达的改变强度(foldchange，fc)，最后比较实时定量pcr和基因芯片的结果。

b)采用cmap法得到中药作用复杂性疾病的潜在相关靶蛋白。

将上述获取的芯片数据代入cmap(connectivitymap)数据库中进行分析，获得潜在的相关靶蛋白。

(a)计算探针的fc(sns/model)值，当探针的fc(sns/model)绝对值大于1.2，且p<0.05时，定义为显著差异表达的探针；

(b)根据探针改变的幅度大小，挑选中药芯片数据中上调或下调幅度最大的显著差异表达的探针与cmap数据库中的芯片数据进行相似度匹配，找到与中药相关性最强的化合物；

(c)根据stitch4.0数据库中化合物-蛋白质相互作用的数据信息，得到中药潜在作用蛋白靶点。

c)采用eor法得到中药作用复杂性疾病的潜在相关基因。

根据芯片数据计算节点的回调状态；

式(6)中，rl′表示回调状态；loge为各实验组的基因表达水平取log2对数后的均值；edrug为中药给药组的芯片数据；esham为假手术组的芯片数据；emodel为模型对照组的芯片数据。

再计算节点的回复调控效率(efficiencyofrecoveryregulation，eor)

eor＝100％-|100％-rl′|(7)

式(7)中，eor表示为回复调控效率(efficiencyofrecoveryregulation)，是用于表征节点(芯片数据)回调效率的指标；rl′表示回调状态。

根据计算，eor大于0的节点对复杂性疾病所致“失和”生物分子网络具有复衡贡献，而eor小于等于0的节点对其贡献值为0。故，定义eor值大于0的节点为获得的潜在相关基因。

d)整合相关靶蛋白和相关基因，得到中药作用复杂性疾病的靶蛋白列表，再通过靶蛋白列表构建中药相关的复杂性疾病所致的“失和”生物分子网络。

(a)对潜在相关靶基因和潜在相关靶蛋白之间的对应关系进行合并，去重；

(b)应用davidbioinformaticsresources6.7软件对靶蛋白列表进行通路富集分析，找到所述复杂性疾病相关的生物学信号通路，定义p<0.05为显著富集通路；

(c)以kegg数据库中所述显著富集通路为基础，构建所述“失和”生物分子网络。

(2)计算获得中药对复杂性疾病所致“失和”生物分子网络的调控力度值。

a)利用中药中入血成分与“失和”生物分子网络中靶蛋白的对接得分值，计算“失和”生物分子网络中各连接的权重；

式(1)中，scomp表示中药中入血成分与网络中蛋白进行分子对接的得分值；sreference表示网络中蛋白质复合结构的原始配体与蛋白进行分子对接的最低得分值；ew表示网络中的任何一个节点到下游直接节点的连接的权重；

b)将权重代入式(2)和式(3)中，计算获得网络效能和网络流；

式(2)中，dwij为网络中节点i与节点j之间的最短距离，即节点i到节点j之间所经过的边的权重之和最小；n为网络中所有节点的集合；ne为网络效能，即网络中任何一个节点i到下游节点j的最短路径的倒数和；

式(3)中，dwim为网络中节点i与节点m之间的最短距离，即节点i到节点m之间所经过的边的权重之和最小；n为网络中所有节点的集合；nf为网络流，即网络中任何一个节点i到网络中叶节点m的最短路径的倒数和；leafnode表示叶节点，是指网络中出度为0的节点；

c)将网络效能和网络流代入式(4)中，计算获得中药中入血成分对所述“失和”生物分子网络的调控能力；

式(4)中，当所述“失和”生物分子网络中所有连接的权重均为初始值1时，计算得到nemax和nfmax；necomp表示中药中单个化合物对所述“失和”生物分子网络的网络效能，nfcomp表示中药中单个化合物对所述“失和”生物分子网络的网络流；re表示中药中入血成分对所述“失和”生物分子网络的调控能力；

d)将“失和”生物分子网络的调控能力代入式(5)中，计算得到中药对复杂性疾病所致“失和”生物分子网络的调控力度值；

式(5)中，k表示中药中的入血成分，g表示中药中所有入血成分的集合，ak表示成分k在中药所有入血成分中所占的峰面积百分比，fre表示中药对复杂性疾病所致“失和”生物分子网络的调控力度值。

其中，入血成分在中药所有入血成分中所占的峰面积百分比根据实验数据获得，具体的实验方法如下：

动物实验：禁食过夜的sd大鼠用于动物实验。灌胃前，收集空白血样约1ml，然后随机分成5组，根据组别分别灌胃给药四逆汤类方，给药量3.2ml/100g体重(具体见表1)，给药60min后，乙醚麻醉，通过眼眶静脉收集给药后的血样，4000rpm离心15min，取上清血浆，置-80℃冰箱保存。

液质联用分析用血浆样品制备：取血浆样品500μl，加入乙腈1000μl，涡旋30s，10000rpm离心10min。35℃下离心浓缩，残渣中加入100μl甲醇复溶，10000rpm离心10min，取上清液备用。

液相色谱分离：应用配备二元泵的agilent1100型液相色谱仪(agilent公司，德国)和zorbaxeclipsexdb-c18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm，agilent公司，美国)开展色谱分离实验。流动相分别为0.05％甲酸-水(a)和0.05％甲酸-乙腈(b)。采用梯度洗脱，梯度设置如下：0-50min，5-30％b；50-75min，30-50％b；75-80min，50-95％b；80-90min，95％b。流速为0.6ml/min，柱温30℃，类方提取物样品进样体积为20μl，血浆样品进样体积为30μl。光电二极管阵列检测器(photodiodearray,pda)波长设置为190nm到400nm。

质谱分析：应用配备电喷雾离子化接口(esi)的finniganlcqdecaxpplus离子阱质谱仪(thermo公司，美国)采集多级质谱数据。仪器实验参数如下：全扫描范围，质荷比(m/z)100-1500；正离子模式电离电压+4.00kv，负离子模式为–3.00kv；毛细管温度350℃；鞘气(n2)60arb；辅助气(n2)20arb。毛细管电压19v；透镜管电压25v。多级质谱数据由xcalibur2.1，qualbrowser数据工作站处理分析(thermo公司，美国)。

表1四逆汤类方动物实验口服单次给药量

^a日给药量指每千克大鼠每天服用的剂量，大鼠日给药量是根据体重和体表面积按人体等效剂量进行换算得来。

^b口服单次给药量是本次实验中的确切给药量，综合大鼠单次最大口服体积和四逆汤类方的溶解性，口服单次给药量为日给药量的8倍(3.2ml/100g体重)。

(3)比较不同中药之间的调控力度值，评价各中药对所述“失和”生物分子网络的调控能力。

对每个网络所有中药对应的fre值进行归一化处理，并将归一化后的结果分为a-f六个等级(a：0.8-1；b：0.7-0.8；c：0.6-0.7；d：0.5-0.6；e：0.5-0.4；f：0-0.4)。

采用随机化检验(randomizationtest)方法检验基于成分与蛋白对接模拟得分值设计的网络评价结果是否可靠。在随机检验过程中，将dockingscore值进行随机排序，按照计算流程重新计算中药对网络的调控能力，该过程重复10万次。

最终，将计算得到的fre值与随机获得的10万个fre值进行单样本t检验。

结果显示p值趋近于0，表明基于成分与蛋白对接模拟得分值设计的网络评价结果是可靠的(不是随机结果)。

应用例1

针对四逆汤类方相关的急性心肌梗塞所致的“失和”生物分子网络，本应用例采用本发明方法来评价五首四逆汤类方对其“失和”生物分子网络的调控力度，并通过斑马鱼实验来验证本发明方法。

一、评价五首四逆汤类方对急性心肌梗塞所致的“失和”生物分子网络的调控力度

(1)获取四逆汤类方对急性心肌梗塞的潜在作用靶点，利用所述潜在作用靶点构建“失和”生物分子网络

a)获取四逆汤类方作用于急性心肌梗塞的芯片数据；

以大鼠为研究对象，构建其急性心肌梗塞模型，对患有急性心肌梗塞的大鼠实施灌胃给药进行疾病的治疗，取大鼠的心肌组织用于基因芯片检测，获得芯片数据。

①实验组别及剂量的设置

根据《伤寒论》中人的日给药量换算得到动物实验中大鼠的日给药量，给药采用的中药共有五种，分别为：四逆汤sin、四逆加人参汤rsin、茯苓四逆汤fsin、通脉四逆汤tsin和通脉四逆加猪胆汁汤zsin，药材组成详见表2；组别设置和给药剂量见表3。

表2四逆汤类方药材组成

临用前每首类方称重，加适量milli-q水溶解、混匀并定容至每首类方的给药体积为1ml/100g。

表3分组情况及药物剂量、浓度和给药体积

②大鼠急性心肌梗塞模型的制备

sd大鼠，禁食过夜，自由饮水。实验当天腹腔注射360mg/kg水合氯醛麻醉，每只肌注0.1ml盐酸利多卡因抗心律失常。开胸前连接alc-v8呼吸机，开胸后迅速于大鼠左侧第三和第四肋间小心掏出心脏，并用6/0线结扎冠状动脉左前降支，其中假手术组大鼠只穿线不结扎。结扎后小心将心脏放回胸腔，排尽胸腔内空气，用4/0线缝合肌肉组织和皮肤。每只大鼠肌肉注射青霉素16万单位。手术后第二天，通过眼眶取血方法对手术后存活的大鼠进行采血，血液室温静置30min后4℃下4000rpm/min离心15min，取上清测定大鼠血清中心肌肌钙蛋白t(ctnt)的浓度。根据ctnt浓度判断大鼠急性心肌梗塞模型的成功与否。

③取材

ttc用心肌组织取材：sd大鼠称重，腹腔注射360mg/kg水合氯醛麻醉后，腹主动脉取血后，用20ml预冷的生理盐水对心脏进行灌流后，剪下心脏于预冷的生理盐水中清洗。剔除结缔组织和右心室等后取结扎线以下的部位置于预冷的2ml冻存管中，再-80℃贮存备用。

基因芯片检测用心肌组织取材：所用手术器械使用之前首先用含有0.1％depc水处理，再进行高压灭菌并烘干。用20ml预冷的含0.1％depc生理盐水对心肌进行灌流后，剪下心脏置于预冷的含0.1％depc生理盐水中清洗，并剔除结缔组织和右心室等。取结扎线以下梗死和正常心肌交界区的心肌组织两份，每份约150mg，用铝箔纸包装后分别置于预冷的2ml冻存管中，迅速于液氮中冻存，之后再-80℃贮存备用。

④心肌梗死范围测定

待心肌组织冻僵硬后，沿冠状面均匀切成4-5片心肌组织并置于2％ttc溶液中，37℃水浴避光加热5min左右，在孵育过程中用镊子小心翻动心肌切片，使得心肌切片的两面都能充分与2％ttc反应。最终心肌非梗死区呈现红色，梗死区则是白色，应用美国国立卫生研究院(nih)发布的公共图像统计软件imagej1.48对心肌梗死范围(infarctsize)进行统计。

⑤四逆汤类方对急性心肌梗塞大鼠心肌梗死范围的影响

急性心肌梗塞模型对照组和给药组大鼠给药结束后，取心脏以2％ttc染色法评价大鼠的心肌梗死范围。急性心肌梗塞模型对照组大鼠平均梗死范围为38.7±8.8％。四逆汤、茯苓四逆汤、通脉四逆汤和通脉四逆加猪胆汁汤灌胃给药7d后，能显著减少大鼠冠状动脉左前降支结扎引起的心肌梗死范围，但各中药影响程度各不同，具体参见图2a。四逆加人参汤灌胃给药7d后能减轻大鼠心肌梗死的程度，但未达到统计学显著性差异(rsinvsmodel，p＝0.066)。图2b展示了ttc染色标记的大鼠心肌梗死范围。

⑥基因芯片实验及数据预处理

本发明中所采用的芯片为affymetrixratgenome2302.0array，该芯片平台为大鼠全基因组芯片，共包括31099个探针。共检测35个样本，分为假手术组(sham)和模型对照组(model)、四逆汤组(sin)、四逆加人参汤组(rsin)、茯苓四逆汤组(fsin)、通脉四逆汤组(tsin)和通脉四逆加猪胆汁汤组(zsin)，每组样本数均为5。

应用mirvana^tmrnaisolationkit(appliedbiosystemp/nam1556)试剂盒提取心肌样品的总rna。利用nanodropnd-2100对样品总rna进行定量并采用agilentbioanalyzer2100检测rna完整性。

质检合格后，采用affymetrix表达谱芯片配套试剂盒，参照标准操作流程进行样本标记、芯片的杂交以及洗脱等。经affymetrixscanner3000扫描得到原始图像并利用agcc软件(affymetrixgenechipcommandconsoleversion4.0)提取得到原始数据(.cel格式)。原始数据导入arraytrack软件中，应用mas5算法进行背景校正，再对所有数据进行中位数1000的标准化处理，方便后续芯片之间的比较研究。

⑦基因芯片实验结果验证

对同一批rna样本，采用实时定量pcr(real-timequantitativepcr)实验验证芯片数据结果的可靠性。txn2、pkp2、cxcl12、cacnb2和gapdh的引物由上海祥音生物科技有限公司合成，其中gapdh为内参基因。

实时定量pcr验证实验过程分为3个步骤。

1)rna逆转录合成cdna。采用ambion动物试剂盒抽提大鼠心脏组织中rna。样品中rna浓度采用nanodrop2000spectrophotometer进行测定，再按照逆转录试剂盒的标准操作流程逆转录合成cdna。

2)样品实时定量pcr测定。引物经适量depc水溶解后得到100μm的引物储备液，再根据quantifastsybrgreenpcrkit试剂盒的标准操作流程进行样品的实时定量pcr检测。

3)应用2^-δδct方法计算基因转录水平表达的改变强度(foldchange)，最后比较实时定量pcr和基因芯片的结果。

b)采用cmap法得到四逆汤类方作用急性心肌梗塞的潜在相关靶蛋白

将上述获取的芯片数据代入cmap(connectivitymap)数据库中进行分析，获得潜在相关靶蛋白。

(a)将中药给药组分别与模型对照组相比较，当探针的fc(sns/model)绝对值大于1.2，且p<0.05时，定义为显著差异表达的探针；

(b)根据探针改变的幅度大小，挑选每首四逆汤类方芯片数据中上或下调幅度最大的各150个显著差异表达的探针与cmap数据库中的芯片数据进行相似度匹配，找到与四逆汤类方相关性最强的化合物；

(c)根据化合物-蛋白质相互作用数据(stitch4.0数据库)，得到五首四逆汤类方潜在作用蛋白靶点。

c)采用eor方法得到四逆汤类方作用急性心肌梗塞的潜在相关基因，具体为：

根据芯片数据计算节点的回调状态；

式(6)中，rl′表示回调状态；loge为各实验组的基因表达水平取log2对数后的均值；edrug为中药给药组的芯片数据；esham为假手术组的芯片数据；emodel为模型对照组的芯片数据。

再计算节点的回复调控效率(efficiencyofrecoveryregulation，eor)

eor＝100％-|100％-rl′|(7)

式(7)中，eor表示为回复调控效率(efficiencyofrecoveryregulation)，是用于表征节点(芯片数据)回调效率的指标；rl′表示回调状态。

根据计算，eor大于0的节点对复杂性疾病所致“失和”生物分子网络具有复衡贡献，而eor小于等于0的节点对其贡献值为0。故，定义eor值大于0的节点为获得的潜在相关基因。

d)整合相关靶蛋白和相关基因，得到四逆汤类方作用急性心肌梗塞的靶蛋白列表，再通过靶蛋白列表构建四逆汤类方相关的急性心肌梗塞所致的“失和”生物分子网络。

a)对潜在相关靶基因和潜在相关靶蛋白之间的对应关系进行合并，去重；

b)在通晓冠心病主要病理环节的基础上，对四逆汤类方治疗急性心肌梗塞相关的潜在作用靶点进行整合分析(见表4)。

表4冠心病发生发展相关的病理过程

c)应用davidbioinformaticsresources6.7软件中functionalannotationtool工具下的pathways模块对靶蛋白列表进行通路富集分析，研究其涉及的生物学信号通路。其中pathways模块下的分类选用kegg数据库，显著通路定义为p<0.05。

d)综合考虑冠心病相关的各病理环节和关键生物分子显著富集通路的p值，选以kegg通路calciumsignalingpathway(钙离子信号通路)、erbbsignalingpathway(erbb信号通路)、vascularsmoothmusclecontraction(血管平滑肌收缩通路)、insulinsignalingpathway(胰岛素信号通路)和steroidhormonebiosynthesis(类固醇激素的生物合成)为基础，构建四逆汤类方相关的急性心肌梗塞所致的“失和”生物分子网络(见图3)

(2)计算获得四逆汤类方对复杂性疾病所致“失和”生物分子网络的调控力度值。

a)利用四逆汤类方中入血成分与“失和”生物分子网络中靶蛋白的对接得分值，计算“失和”生物分子网络中各连接的权重；

在pdb蛋白数据库中搜索相关“失和”生物分子网络中四逆汤类方作用的靶蛋白的三维结构，应用moe软件完成蛋白质和化合物的分子对接工作，得到四逆汤类方中入血成分和生物分子网络中靶蛋白的对接得分值；

设定网络中所有连接的初始权重为1，最大权重为200。每一个网络中蛋白质复合结构中的原始配体与该蛋白进行分子对接模拟，选取最低得分值作为该网络的sreference；

式(1)中，scomp表示中药中入血成分与网络中蛋白进行分子对接的得分值；sreference表示网络中蛋白质复合结构的原始配体与蛋白进行分子对接的最低得分值；ew表示网络中的任何一个节点i到下游直接节点j的连接的权重；

b)将权重代入式(2)和式(3)中，计算获得网络效能和网络流；

式(2)中，dwij为网络中节点i与节点j之间的最短距离，即节点i到节点j之间所经过的边的权重之和最小；n为网络中所有节点的集合；ne为网络效能，即网络中任何一个节点i到下游节点j的最短路径的倒数和；

式(3)中，dwim为网络中节点i与节点m之间的最短距离，即节点i到节点m之间所经过的边的权重之和最小；n为网络中所有节点的集合；nf为网络流，即网络中任何一个节点i到网络中叶节点m的最短路径的倒数和；leafnode表示叶节点，是指网络中出度为0的节点；

c)将网络效能和网络流代入式(4)中，计算获得四逆汤类方中入血成分对所述“失和”生物分子网络的调控能力；

式(4)中，当所述“失和”生物分子网络中所有连接的权重均为初始值1时，计算得到nemax和nfmax；necomp表示中药中单个化合物对所述“失和”生物分子网络的网络效能，nfcomp表示中药中单个化合物对所述“失和”生物分子网络的网络流；re表示中药中入血成分对所述“失和”生物分子网络的调控能力；

d)将“失和”生物分子网络的调控能力代入式(5)中，计算得到四逆汤类方对急性心肌梗塞所致“失和”生物分子网络的调控力度值；

式(5)中，k表示中药中的入血成分，g表示四逆汤类方中所有入血成分的集合，ak表示成分k在四逆汤类方所有入血成分中所占的峰面积百分比，fre表示四逆汤类方对急性心肌梗塞所致“失和”生物分子网络的调控力度值。

(3)比较不同中药之间的调控力度值，评价各中药对所述“失和”生物分子网络的调控能力。

对每个网络所有四逆汤类方对应的fre值进行归一化处理，并将归一化后的结果分为a-f六个等级(a：0.8-1；b：0.7-0.8；c：0.6-0.7；d：0.5-0.6；e：0.5-0.4；f：0-0.4)。

采用随机化检验(randomizationtest)方法检验基于成分与蛋白对接模拟得分值设计的网络评价结果是否可靠。在随机检验过程中，将dockingscore值进行随机排序，按照计算流程重新计算中药对网络的调控能力，该过程重复10万次。

最终，将计算得到的fre值与随机获得的10万个fre值进行单样本t检验。

结果显示p值趋近于0，表明基于成分与蛋白对接模拟得分值设计的网络评价结果是可靠的(不是随机结果)。

实验结果如下：

随机化检验结果显示各个中药对不同网络计算得到的fre值与相应随机获得的10万个fre值进行单样本t检验时，p值趋近于0，表明基于成分与蛋白对接模拟得分值设计的网络评价结果是可靠的。

fre值归一化后的四逆汤类方各个中药结果如图4所示，该图清楚地展示了各个中药对其相关“失和”生物分子网络调控强弱的侧重。五首四逆汤类方对钙离子稳态相关“失和”网络(net.calcium)调控力度一致，均能很好的调控缺氧缺血导致的细胞内钙离子紊乱。而四逆加人参汤和茯苓四逆汤对促血管新生相关的血管新生相关“失和”网络(net.angiogenesis)具有更强的调控力度。通脉四逆加猪胆汁汤对能量代谢相关“失和”网络(net.energymetabolism)、血管平滑肌收缩相关“失和”网络(net.vsmcontraction)和类固醇激素合成相关“失和”网络(net.steroid)具有更强的调控作用。而通脉四逆汤相比四逆汤而言，对血管新生相关“失和”网络、能量代谢相关“失和”网络、血管平滑肌收缩相关“失和”网络和类固醇激素合成相关“失和”网络的调控力度均有所增加。

如图4所示，四逆加人参汤和茯苓四逆汤对促血管新生相关的血管新生相关“失和”网络(net.angiogenesis)具有比其他方剂更强的调控力度。早在上个世纪末，有学者通过基因敲除手段发现erbb受体在心血管系统有表达，而且在心脏的发育过程中起作用。一方面，her2被heregulin激活后，可通过促进内皮细胞生长、增殖、迁移，促进内皮细胞募集平滑肌细胞等作用直接调控血管生成。另一方面，her2激活后还可通过vegf依赖性的方式间接调控血管新生。进一步，实验研究表明抗her2单克隆抗体可通过下调her2的表达，弱化her2的二聚化等机制发挥抗血管新生的作用。

如图4所示，通脉四逆加猪胆汁汤对能量代谢相关“失和”网络(net.energymetabolism)、血管平滑肌收缩相关“失和”网络(net.vsmcontraction)和类固醇激素合成相关“失和”网络(net.steroid)具有比其他方剂更强的调控作用。研究表明胰岛素抵抗与心力衰竭之间存在着密切的联系，胰岛素信号调控在缺血性心脏保护以及延缓心衰的发生发展中具有重要作用。心肌缺血引发胰岛素抵抗后，不仅上调了脂肪酸的代谢，同时也抑制了葡萄糖的摄取和代谢，导致心肌耗氧量增加，心肌能力代谢紊乱，从而加剧冠心病的发展，诱发冠心病心力衰竭。此外，当心肌缺血时，活性氧的增加、胞浆内ca²⁺浓度的超载和能量代谢紊乱等会引发血管内皮功能失调，no释放量减少，从而抑制鸟苷酸环化酶的活化，减少平滑肌细胞内环鸟苷酸(cgmp)的产生，导致平滑肌舒张功能障碍，收缩异常，血压升高甚至出现痉挛。而正常血液循环的维持有赖于正常的心肌舒缩功能、正常的血管舒缩功能和足够的循环血量。

针对上述结果，选择以斑马鱼血管缺失模型来验证rsin和fsin是否比其他类方具有更强调控血管新生相关“失和”网络的作用。选以斑马鱼心衰模型来验证zsin是否比其他类方具有更强调控能量代谢相关“失和”网络、血管平滑肌收缩相关“失和”网络和类固醇激素合成相关“失和”网络的作用。具体内容如下：

1、实验材料

辛伐他汀：日本tci公司，批号：404-520-2；黄芪甲苷：阿拉丁试剂(上海)有限公司，批号：g1325036；盐酸维拉帕米：上海晶纯实业有限公司，批号：e1216038；地高辛：上海晶纯实业有限公司，批号：d102298。

四逆汤类方粉末：四逆汤、四逆加人参汤、茯苓四逆汤、通脉四逆汤和通脉四逆加猪胆汁汤均自制。深黄色粉末，常温干燥保存，临用前用超纯水配制成工作液，现配现用。

20mm盐酸维拉帕米母液：临用前称取一定量的盐酸维拉帕米粉末，加超纯水配置成20mm母液；0.1mg/ml地高辛母液：临用前称取一定量的地高辛粉末，加dmso配置成0.1mg/ml母液；70mm辛伐他汀母液：临用前称取一定量的辛伐他汀粉末，加dmso配置成70mm工作液；30mm黄芪甲苷母液：称取一定量的黄芪甲苷粉末，加dmso配置成30mm母液，-20℃保存。

解剖显微镜：szx7，olympus；心跳血流分析系统：zebralab3.3(pb2084c)，viewpointlifescience；精密电子天平：cp214，ohaus；电动聚焦连续变倍荧光显微镜：az100，nikon。

斑马鱼的品系与来源：实验动物使用许可证号为：syxk(浙)2012-0171。饲养管理符合国际aaalac认证的要求。1)野生型ab系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后2天或3天(2dpf/3dpf，用于四逆汤类方心衰药效评价实验)。2)转基因fli-1品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后1天(1dpf，用于四逆汤类方促血管形成药效评价实验)。

2、四逆汤类方对斑马鱼促血管再生的药效学检验

随机选取转基因fli-1系1dpf斑马鱼于六孔板中，每孔30尾，用70nm辛伐他汀诱导fli-1系斑马鱼建立微血管缺失模型，3h后移除诱导剂，分别水溶给予不同浓度的类方药液，四逆汤类方给药量根据其最大无可见毒害剂量作用水平(noael)和药效预实验结果设定。阳性对照组同样条件下给予30μm黄芪甲苷(ast)，每孔3ml药液，同时设置正常对照组和模型对照组。给药24h后移除药物，再继续在斑马鱼生化培养箱中培养24h。培养结束后，每组随机取10尾斑马鱼在显微镜下观察肠下血管面积和分支数，拍照并保存图片。

3、四逆汤类方对斑马鱼心衰模型的药效学检验

随机选取野生型ab系斑马鱼于六孔板中，每孔30尾，200μm维拉帕米诱发ab系斑马鱼心衰模型，分别水溶给予不同浓度的四逆汤类方药物，类方给药量根据其noael水平和药效预实验结果设定。阳性对照组给予0.1μg/ml地高辛，每孔3ml药液，给药4h，同时设置正常对照组和模型对照组。给药结束后，每组随机选取10尾斑马鱼拍照并采集数据，分析统计斑马鱼心脏静脉淤血面积；随机选取10尾并置于心跳血流分析系统下录制斑马鱼血流视频，分析斑马鱼的血流速度。

验证结果如下：

从图5的统计结果来看，rsin和fsin对血管缺失斑马鱼肠下血管面积的保护率高达90％以上，tsin和zsin的保护率为60％左右，而sin的保护率接近50％。因此，该实验证明五首四逆汤类方都具有促血管生成的作用，但rsin和fsin的效果最佳，这可能与rsin和fsin对血管新生相关“失和”网络的调控力度更大有关。

图6(b)的统计结果显示，zsin对心衰斑马鱼心脏静脉淤血的改善效果最佳。图6(c)结果显示，zsin和tsin对心衰斑马鱼血流速度的恢复效果明显优于其他三首方剂。因此，改结果该实验初步证明了zsin对治疗心力衰竭具有良好的效果，而且其作用明显优于sin、rsin和fsin，这可能与zsin对能量代谢相关“失和”网络、血管平滑肌收缩相关“失和”网络和类固醇激素合成相关“失和”网络同时具有强调控能力有关。

最后，还需要特别注意的是，以上所举例子仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不仅仅限于以上实施例子，还可以有许多变通的情况。本领域的技术人员从本发明公开的内容直接推导出或联想到的所有变通情况，均认为是本发明的保护范围。