一种基于结构光照明的荧光偶极子定向方法与流程

本发明是关于一种基于结构光照明的荧光偶极子定向方法，涉及超分辨率荧光显微技术领域。

背景技术：

荧光显微是生命科学研究中的一种重要工具。在生命科学研究中，往往对感兴趣的区域进行荧光标记，其受到激发光的照射后，发射的荧光将包含生物体的结构和功能信息，为进一步的研究提供可能。然而，普通的荧光显微系统均使用二维相机传感器采集信号，其仅仅能够获得样本的空间信息。荧光分子大多数为偶极子，其所发出的荧光往往具有较强的偏振特性，这部分特征将被丢失。事实上，偏振信息在一定程度上能够反映出生物体的结构特性，例如：在actin细胞中，偶极子的偏振方向通常垂直于延展方向；利用不同偶极子所发出光的偏振角度的不同，能够将其进行分离，从而提升空间分辨率。因此，对荧光偏振的研究具有重要意义。

目前，常用的荧光偏振研究方法大概可分为三类：第一类利用不同偏振光通过显微系统后的衍射图样的不同，在采集端用相机拍摄偶极子的衍射图样，与原有的图样库进行比对，从而获得偏振信息；第二类利用荧光的各向异性，其使用圆偏振光激发，使得样本受到了各个方向均一强度的照明，在采集端使用偏振分束器，将不同角度的偏振光进行分离，通过采集不同角度的发射光信息，能够计算出空间各个位置的偏振信息；第三类是基于线性二向色性利用旋转的偏振光激发荧光，由于特定偏振方向的荧光分子在不同偏振角度激发下的发射强度不同，通过采集多个激发角度下的二维图像，对其偏振信息进行解调。上述三种现有技术中，第一类需要图像进行高倍放大，相邻偶极子的衍射图像将会重叠，导致难以获得较高的空间分辨率，此外图样比对的精度受到信噪比的影响很大；第二类速度较快，但是分束器使得每张图片上获得的总光强减小，进而信噪比降低，图像的质量下降；第三类系统需要采集多张图片，耗时较长。此外，后两类技术的光路都较为复杂，不利于在商用系统上集成。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的是提供一种能够获取荧光样本的超分辨率偏振信息的基于结构光照明的荧光偶极子定向方法。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种基于结构光照明的荧光偶极子定向方法，其特征在于，包括以下内容：步骤1)：采用结构光显微系统获取具有偏振特性的荧光样本的原始图像和调制信息，并得到不同空间角度所对应的空间频域分量，其中，原始图像是指经结构光显微系统的相机传感器采集到的荧光样本图像，调制信息是指结构光显微系统的调制强度、相位和空间角度；步骤2)：将所有空间频域分量进行空间维度频域拼接得到荧光样本的二维超分辨率空域图像；且将所有空间频域分量的角度维度频域拓展得到荧光样本的偏振角度信息；步骤3)：将荧光样本的二维超分辨率空域图像和偏振角度信息进行匹配得到超分辨率荧光偶极子定向结果。

进一步地，所述步骤1)不同空间角度所对应的空间频域分量的具体计算过程为：步骤1.1)：获取经结构光显微系统采集的荧光样本图像和相应调制信息，其中，x和y为荧光样本图像的像素阵列的横纵坐标，调制信息包括3个不同空间角度θ1，θ2和θ3，对应的调制强度为m1，m2和m3；对于每个空间角度，包括三个不同的相位和步骤1.2)：对所有荧光样本图像分别进行傅里叶变换：

式中，为傅里叶域的频谱，ft为傅里叶算子，θ为空间角度，kx、ky为傅里叶域对应的空间频率；步骤1.3)：根据调制信息，利用三个相位角和获得不同空间角度θ1，θ2和θ3对应位置的频域分量：其中，重复计算三次，其中，kr表示对应的二维空间频率。

进一步地，所述步骤2)将所有空间频域分量进行空间维度频域拼接得到荧光样本的二维超分辨率空域图像的具体过程为：将得到的不同空间角度所对应的空间频域变量分别进行局部维纳滤波后，在空间对应位置直接拼接；拼接完成后再进行一次全局维纳滤波，获得荧光样本的二维超分辨率频域图像；对二维超分辨率频域图像进行傅里叶逆变换后获得相应的二维超分辨率空域图像。

进一步地，所述步骤2)将所有空间频域分量的角度维度频域拓展得到荧光样本的偏振角度信息具体过程为：将在不同空间角度θ下得到的分别记做：和根据荧光样本材料的线性二向色性性质，则应有如下关系：

式中，分别代表在三维频域空间内的角度维度的拓展信息，上述方程组为一个线性方程组，系数矩阵可逆，因此可以得到唯一解：

由于最终的荧光样本图片相当于kα＝0时的频域信息，故最终得到的结果为：将上述三项分别填充至三维频域空间的对应位置，得到三维全空间频域信息将三维全空间频域信息进行反傅里叶变化即可得到空间每个点的角度信息：

式中，ift代表反傅里叶算子，kα表示角度维度的频率，具体地，s(r0,α)中幅值最大的角度即为空间位置r0处的荧光偶极子的偏振角度。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明采用结构光显微系统获取具有偏振特性的荧光样本的原始图像和调制信息，并得到不同空间角度的空间频域分量；将所有空间频域分量进行空间维度频域拼接得到荧光样本的二维超分辨率图像；且将所有空间频域分量的角度维度频域拓展得到荧光样本的偏振角度信息；将荧光样本的二维超分辨率图像和偏振角度信息进行匹配得到超分辨率荧光偶极子定向结果，因此本发明在结构光显微镜上直接实现了超分辨荧光偶极子偏振角度成像，没有引入任何新的硬件系统，成本低廉，易于实现，有着很强的推广价值和重大研究意义。2、本发明采用商用结构光显微系统获取具有偏振特性的荧光样本的原始图像和调制信息，并在普通pc或工作站上实现数据处理，因此本发明将结构光技术和线性二向色性技术相结合，实现了超分辨率的荧光偶极子方向成像，解析出荧光偶极子的偏振信息，对原有技术有着较大的性能提升。

附图说明

图1为现有结构光显微系统的结构示意图；

图2为结构光显微和线性二向色性的示意图，图(a)是结构光显微空域的莫尔条纹示意图及其空间维度的频域示意图，图(b)是线性二向色性的强度响应函数示意图及其在角度维度的频域示意图；

图3为本发明基于结构光照明的荧光偶极子定向方法的总体流程图；

图4为本发明中频域拼接示意图。

具体实施方式

以下结合附图来对本发明进行详细的描绘。然而应当理解，附图的提供仅为了更好地理解本发明，它们不应该理解成对本发明的限制。

普通光学系统的点扩散函数通常为一个高斯斑，其在频域上为低通滤波器。由于采集到的图片可以视为荧光样本信息与系统点扩散函数的卷积，因此，普通的成像过程可以视为在频域上的选频。由于高频信息的丢失，在空域上的小尺度变化信息不能获得，进而系统的分辨率受到了限制。因此经过结构光照射后，系统光学传递函数在傅里叶域上进行了频域的拓宽。原有的高频信息被平移后，可以被相机传感器所接受。将采集到的图像经过傅里叶变换后，平移到傅里叶域的相应位置，然后将各个图像进行拼接，进而提升了空间分辨率。现有商用结构光显微系统一般能够提升两倍的空间分辨率。为了更加清楚地对本发明的基于结构光照明的荧光偶极子定向方法进行阐述，下面先对结构光显微技术和线性二向色性两部分内容进行简要说明：

1、结构光显微技术

结构光显微系统为现有的商业产品，其是在普通荧光显微技术的基础上，在激发端进行了调制。如图1所示，现有结构光显微系统包括偏振光源、物镜、二向色镜、筒镜、光栅和相机传感器，其利用了光栅或者两束相干光进行干涉，在荧光样本的激发面上形成了莫尔条纹。莫尔条纹在空间域上，可以用二维余弦函数进行表达。为了简便起见，记矢量r＝(x,y)来表示二维空间位置，kr＝(kx,ky)来表示对应的二维空间频率。

式中，i(r)为空间位置r处的光强，i0为入射光强，m为调制强度，θ为调制角度，pθ为θ对应的空间矢量，为调制相位。

上述在空间频域的对应形式为：

式中，为空间光强在傅里叶域的表达形式，δ为频域冲击函数。

2、线性二向色性

如图2所示，线性二向色性用来描述材料在不同偏振光激发下的特性。其主要受到粒子的发射光的偏振角度和激发光的偏振角度所决定，服从余弦平方的关系：

fθ(α)＝ηcos²(α-θ)

式中，fθ(α)为发射强度函数，η为偏振调制因子，α为样本固有的偏振角度，θ为激发光的偏振角度(在商用结构光显微系统中，其激发光的偏振角度与结构光的调制角度相同，这里统一记为θ)。上式在频域中的表达形式为：

式中，为发射强度函数在角度维度频域的表达形式，δ为冲激函数，kα表示角度维度的频率。

如图3所示，本发明提供的基于结构光照明的荧光偶极子定向方法，包括以下内容：

1、采用结构光显微系统获取具有偏振特性的荧光样本的原始图像和调制信息，获得不同空间角度所对应的空间频域分量，其中，原始图像是指经结构光显微系统的相机传感器采集到的荧光样本图像，调制信息是指结构光显微系统的调制强度、相位和空间角度，具体过程为：

1.1)获取经相机传感器采集的荧光样本图片

在普通商用结构光显微镜的照射光调制过程中，为了获得最大的对比度，其本身就对激发光进行了偏振调制，使得其偏振方向与条纹方向一致。因此这个过程等价于荧光样本受到了偏振光的激发，每张图像为在特定偏振角度下的采集。具体地，使用θ和来表示结构光莫尔条纹的方向和相位，则在商用结构光显微系统中，激发光的偏振角度也为θ。记相机传感器采集的荧光样本图像为：其中，x和y为采集荧光样本图像的像素阵列的横纵坐标。在商用结构光显微系统中，通常使用3个不同空间角度θ1，θ2和θ3，对应的调制强度为m1，m2和m3；对于每个空间角度，使用了三个不同的相位和本发明实施例以采集的荧光样本图像为9张进行示例说明，以此为例，不限于此，并配有注明上述参数的调制信息文件。

1.2)对每一张荧光样本图像分别进行傅里叶变换：

式中，为所对应的傅里叶域的频谱，kx、ky为傅里叶域对应的空间频率，ft为傅里叶算子，θ为空间角度。为了简化表达，记矢量r＝(x,y)来表示二维空间位置，kr＝(kx,ky)来表示对应的二维空间频率。

1.3)根据已知的调制信息，利用三个相位角和获得不同空间角度θ1，θ2和θ3对应位置的频域分量，其中，某个空间角度θ对应的频域分量的计算过程为：

式中，和代表在空间维度的三个频域分量，kθ为方向θ对应的空间频率，mθ为方向θ对应的调制强度。上述方程组为一个线性方程组，系数矩阵可逆，因此可以求得得到唯一的解：

对三个不同空间角度θ1，θ2和θ3，分别按照上述计算公式得到7个空间频域变量：其中，被重复计算三次。

2、将所有空间频域分量进行空间维度频域拼接得到荧光样本的二维超分辨率空域图像，具体过程为：

如图4所示，将步骤1中得到的不同空间角度所对应的空间频域变量分别进行局部维纳滤波后，在空间对应位置直接拼接；拼接完成后再进行一次全局维纳滤波，获得荧光样本的二维超分辨率频域图像；对二维超分辨率频域图像进行傅里叶逆变换后获得相应的二维超分辨率空域图像，其中，拼接过程为现有技术，在此不做赘述。

3、将所有空间频域分量的角度维度频域拓展得到荧光样本的偏振角度信息，具体过程为：

将步骤1中在不同空间角度θ下得到的分别记做：和根据荧光样本材料的线性二向色性性质，则应有如下关系：

式中，分别代表在三维频域空间内的角度维度的拓展信息。上述方程组为一个线性方程组，系数矩阵可逆，因此可以得到唯一解：

由于相机传感器对于偏振角度的响应不敏感，故最终采集到的荧光样本图片相当于kα＝0时的频域信息。故最终得到的结果为：将上述三项分别填充至三维频域空间的对应位置，得到三维全空间频域信息将三维全空间频域信息进行反傅里叶变化即可得到空间每个点的角度信息：

式中，ift代表反傅里叶算子。具体地，s(r0,α)中幅值最大的角度即为空间位置r0处的荧光偶极子的偏振角度。

4、将荧光样本的二维超分辨率空域图像和偏振角度信息进行匹配得到超分辨率荧光偶极子定向结果，具体过程为：将步骤2和步骤3中的频域信息相结合，能够得到一张超分辨率的二维空间图像和一张低空间分辨率带有角度信息的图像，将二者按照位置进行匹配，即可得到超分辨率偶极子定向结果，其中，匹配可以采用现有算法，具体不做赘述。

综上，由于在商用结构光显微系统的照射光调制中，为了获得最大的对比度，其自身就对激发光进行了调制，使得偏振方向与条纹方向一致。因此，这个过程等价于荧光样本受到了偏振光激发，每张图片均在特定偏振角度下得到的采集，在获得超分辨率图片的同时，角度的高频信息同样可以被重建。因此，本发明的基于结构光照明的荧光偶极子定向方法可以和商用结构光显微系统完美对接。

上述各实施例仅用于说明本发明，其中方法的各实施步骤等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。