压电薄膜谐振器、其制作方法及进行凝血时间检测的方法与流程

本发明属于临床医学检测领域，尤其涉及一种压电薄膜谐振器、其制作方法及进行凝血时间检测的方法。

背景技术：

血液凝血时间检测是外科手术术前重要的常规检查之一，同时其临床结果提示了多种血栓类疾病或出血病风险。另外，对于使用抗凝药的病人，凝血时间的检测结果是调整抗凝药使用剂量的重要参考依据。特别是对于某些需长期服用的口服抗凝药，如华法林等，抗凝效果对个体差异较大，与其他药物的相互作用复杂，并且天然食物也对其抗凝作用有影响。因此，为保证抗凝效果和避免出血风险，病人需要经常到医院检查各项凝血时间，并适时调整药物剂量，给生活带来一定不便。

目前凝血时间检测的仪器有多种，但大多数仪器结构较为复杂，需要专业操作，所需样品数量较多，检测成本较高，不适合长期口服抗凝药病人在家庭中的日常检测。因此，小型化、自动化的凝血时间检测技术受到广泛的关注。

根据检测原理，目前血凝时间检查方法可分为凝固法及底物显色法两类。凝固法通过检测血液样品在凝血激活剂作用下的一系列光学、电学、力学等物理量变化确定血凝固时间。免疫比浊法利用抗原与抗体之间特异性结合的特点，使待测物与标记有其特异性抗体的微粒结合，导致反应体系的浊度发生变化，通过检测其光强度的变化定量待测物的方法。

目前已存在一些小型化、自动化的凝血时间检测技术。

公开号为CN 103487377A的中国专利公开了一种全血凝血功能检测仪及检测方法，包括用于放置全血的检测器皿、与检测器皿连接的旋转装置、光波发生器、光波接收器、计时器以及壳体。旋转装置用于驱动检测器皿绕自身中心轴旋转，光波发生器和光波接收器对向设置在检测器皿的两侧。当检测器皿内的全血没有凝结时，在检测器皿旋转过程中，光波接收器始终持续接收到较强的光波发生器发射的光或不能或仅能接受到光波发生器发射的微弱光信号。计时器用于记录加入凝血试剂到光波接收器第一次不能接收到、或不能稳定接收到光波发生器发射的光的时间，或第一次接收到较强的光信号的时间。

公开号为CN 105588945A的中国专利公开了一种微流控凝血检测装置及其检测方法，包括盘片本体，所述盘片本体上安装有1个以上的凝血检测单元。凝血检测单元包括全血注入槽，全血注入槽与血浆废液槽相连通安装，还与1个以上的快速混合单元相连通安装。快速混合单元与血浆废液槽相连通安装。该微流控凝血检测装置及其检测方法高效、稳定、简便，能以全血样本直接进样，不需额外的样本前处理，能够快速达到全血分离、定量血浆传送、超快速混合等步骤。

2010年期刊《Analytical Chemistry》82卷658页题为“Investigation of Prothrombin Time in Human Whole-Blood Samples with a Quartz Crystal Biosensor”的论文报道了一种采用石英微天平传感器(quartz crystal microbalance，QCM)进行凝血时间检测的方法。该方法利用石英微天平传感器的谐振频率对外部液体粘性敏感的特点。将血液样品置于石英微天平表面，当发生凝血过程时，血液粘性发生变化，从而导致谐振频率下降和谐振衰减。通过测量石英微天平的谐振频率和阻尼特征系数，确定血液样品的凝血时间。

上述技术方案的缺点在于，(1)仪器结构复杂，制造难度较大；(2)使用的血液样品量较多，需要专门采血和处理，不适合家庭使用；(3)测试过程中引入的外界噪声较大，确定凝血时间点的方法不够可靠，测试结果需进一步进行校准。

由此可见，现有技术有待于进一步的改进和提高。

技术实现要素：

本发明为避免上述现有技术存在的不足之处，提供了一种压电薄膜谐振器、其制作方法及进行凝血时间检测的方法。

本发明所采用的技术方案为：

一种用于凝血检测的压电薄膜谐振器，包括压电膜层及设置在压电膜层上的上表面电极，压电膜层上开设有环形凹槽，环形凹槽的内表面涂覆有具有亲水性的聚合物材料，环形凹槽内表面涂覆具有亲水性的聚合物材料后进行过氧等离子处理或紫外光照射,且环形凹槽内表面沉积有一层碳酸钙。

所述环形凹槽的宽度不小于压电薄膜谐振器上表面电极的最大宽度，环形凹槽的深度不小于压电薄膜谐振器压电膜层厚度的三分之一，环形凹槽内环与压电薄膜谐振器上表面电极之间的距离范围为上表面电极的最大宽度的1倍至1.5倍。

所述具有亲水性的聚合物材料为聚丙烯酸、甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚四氢呋喃醚、聚丁二醇的一种或多种。

所述具有亲水性的聚合物材料的厚度为100纳米至200纳米。

本发明还公开了一种上述用于凝血检测的压电薄膜谐振器的制作方法，该方法包括如下步骤：

步骤1，在压电膜层上刻蚀所述环形凹槽；

步骤2，在所述环形凹槽的内表面涂覆具有亲水性的聚合物材料；

步骤3，对所述环形凹槽的内表面进行氧等离子处理或紫外光照射；

步骤4，将压电薄膜谐振器置于碳酸钠溶液中，然后在溶液中加入氯化钙溶液；

步骤5，将压电薄膜谐振器取出，烘烤直至干燥。

所述步骤5中，烘烤的温度不应大于100℃。

本发明还公开了一种利用上述制作方法制作出的压电薄膜谐振器进行凝血时间检测的方法，该方法包括如下步骤：

步骤A，在所述环形凹槽中央滴入血液样品与凝血测试试剂的混合液体；

步骤B，持续测量压电薄膜谐振器的谐振频率；

步骤C，根据所记录的稳定后的压电薄膜谐振器谐振频率，计算谐振频率对时间变化的二阶导数，取该二阶导数的最大值作为凝血时间。

所述步骤A中，凝血测试试剂中不含有钙离子。

所述步骤A中，混合液体的最小体积应完全覆盖压电薄膜谐振器的上表面电极，最大体积不超过环形凹槽的体积。

所述步骤A中，若血液样品为事先采集，应进行抗凝处理并存储在低温环境中，以防止血液的自发凝固，测试前，需将血液样品恢复至室温；若血液样品为现采，则可直接使用；不论是事先采集的血液样品还是现采的血液样品，测试时，都需将血液样品进行稀释，稀释完成后在血液样品中加入凝血测试试剂并均匀分散。

由于采用了上述技术方案，本发明所取得的有益效果为：

1、本发明所述的用于凝血检测的压电薄膜谐振器结构简单，易于制造，尺寸较小，仅为毫米量级，可集成于可穿戴电子设备或其他小型电子设备中用于凝血检测。

2、利用本发明所述的方法进行凝血时间检测，测试中消耗的血液样品量较少，仅为微升量级，适合家庭使用。

3、利用本发明所述的方法进行凝血时间检测，频率响应输出噪声小，凝血时间判断准确。

附图说明

图1为本发明实施例所采用的压电薄膜谐振器结构侧视图。

图2为本发明实施例所采用的压电薄膜谐振器结构俯视图。

图3为本发明实施例中滴入混合液体样品后，压电薄膜谐振器谐振频率随时间的变化曲线。

图4为本发明实施例中压电薄膜谐振器谐振频率随时间变化的二阶导数曲线。

图5为本发明采用本发明方法和常规凝血仪对多个血浆样品进行测量比对后的对照图。

具体实施方式

下面结合附图和具体的实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明并不限于这些实施例。

本发明所使用的压电薄膜谐振器，一般由硅基片、支撑膜层、压电层和电极组成，其结构可以是横隔模型、空气隙型以及固体装配型等。为保证在血液粘性环境中薄膜谐振器能够有效的谐振，最好采用以剪切波模式工作的压电薄膜谐振器进行凝血时间的测量。压电薄膜谐振器电极可以是平行排列在压电层上表面，也可以置于压电层的两侧。压电薄膜谐振器电极的形状可以是圆形、方形或其他不规则形状。

现以如图1和图2所示的压电薄膜谐振器为例阐述本发明中用于凝血检测的压电薄膜谐振器。

本实施例中，压电薄膜谐振器为横隔模型结构，进行凝血酶原时间的检测。该器件由硅基片101、支撑膜层102、压电层103和两个平行排列在压电层上表面的圆形电极104、环形电极105组成。由平行的两个电极104、105产生横向电场，激发谐振器工作于剪切波模式。该压电薄膜谐振器可以通过标准的半导体加工工艺结合体硅工艺进行制造。本实施例中，压电薄膜谐振器的支撑膜层102可以采用氧化硅薄膜或氮化硅薄膜，支撑膜层102的厚度为0.8微米。在支撑膜层102的下方器件有效区域范围内，硅基片101被刻蚀，形成悬空的横膈膜结构。压电层103为氮化铝薄膜或氧化锌薄膜，厚度为1微米。电极材料为金材料或其他金属材料，厚度为100纳米。内侧圆形电极104的直径为100微米，外侧环形电极105的宽度为50微米，两电极之间的距离为20微米。

利用本发明所述的制作方法制作压电薄膜谐振器的具体步骤为：

步骤1，在压电薄膜谐振器的压电膜层上刻蚀环形凹槽106。

为保证剪切波振动能量能够有效集中于血液样品范围内，环形凹槽106的宽度、深度以及压电薄膜谐振器电极与环形凹槽106的距离应在适当的范围内。根据优化设计的结果，环形凹槽106的宽度不小于压电薄膜谐振器上表面电极的最大宽度，环形凹槽106的深度不小于压电薄膜谐振器压电膜层厚度的三分之一，环形凹槽106的内环与压电薄膜谐振器上表面电极之间的距离范围为上表面电极的最大宽度的1倍至1.5倍。本实施例中，环形凹槽106的宽度为120微米，环形凹槽106的深度为0.5微米，环形凹槽106内环与上表面电极之间的距离范围为120微米。

刻蚀环形凹槽106的方法可采用湿法刻蚀或干法刻蚀方法。本实施例中，对于氮化铝薄膜，可采用氯基气体或氟基气体的反应离子刻蚀工艺，对于氧化锌薄膜，可采用氯基气体反应离子刻蚀工艺或盐酸基的刻蚀液进行刻蚀。

步骤2，在环形凹槽内表面涂覆具有亲水性的聚合物材料。

该步骤的作用为增强环形凹槽内表面与下述血液液滴之间的接触面积，获得较好的测量效果。所使用的聚合物材料为聚丙烯酸、甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚四氢呋喃醚、聚丁二醇的一种或多种，所使用的聚合物材料优选的厚度为100纳米至200纳米。涂覆的方法可采用旋涂法或蒸镀法。本实施例中，采用旋涂法涂覆聚丙烯酸，厚度为150纳米。

步骤3，对环形凹槽的内表面进行氧等离子处理或紫外光照射。

该步骤的作用为进一步加强环形凹槽内表面对不溶性的纤维蛋白的吸附作用。本实施例中，采用功率密度为10毫瓦每平方厘米的紫外光对环形凹槽内表面的聚合物材料的表面进行照射，时间为10分钟。

步骤4，将压电薄膜谐振器置于碳酸钠溶液中，然后在溶液中加入氯化钙溶液。

该步骤的作用为在压电薄膜谐振器表面沉积一层碳酸钙，当血液样品接触该表面时能够被激活开始凝血过程。压电薄膜谐振器中环形凹槽内表面应置于上方，以使得碳酸钙沉淀到接触血液的表面。碳酸钠溶液和氯化钙溶液的浓度以及反应时间应保证有适当的碳酸钙沉淀在压电薄膜谐振器表面，尤其是环形凹槽的内表面，既不给谐振器较大的负载导致其性能下降，又能够保证激活血液的凝血过程。本实施例中，碳酸钠溶液和氯化钙溶液的浓度均为1摩尔每升，反应时间为5分钟。

步骤5，将压电薄膜谐振器取出，烘烤直至干燥。

为保证压电薄膜谐振器表面上亲水性聚合物材料的稳定，烘烤温度不应大于100摄氏度，时间不宜过长。烘烤前，不能使用高压气体吹压电薄膜谐振器表面，以保证沉淀在压电薄膜谐振器表面的碳酸钙不被破坏。本实施例中，直接将从溶液中取出压电薄膜谐振器，采用80摄氏度烘烤15分钟。

利用上述制作方法制作出的压电薄膜谐振器能够进行凝血时间检测，可以测量多种凝血时间，包括但不限于凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)。使用本发明测量的凝血时间取决于所使用的凝血测试试剂。本发明也可以测试全血或血浆样品。

利用上述制作方法制作出的压电薄膜谐振器进行凝血时间检测的方法，具体包括如下步骤：

步骤A，在压电谐振器环形凹槽106中央滴入血液样品与凝血测试试剂的混合液体。

一般的，如果全血样品或血浆样品为事先采集，应进行抗凝处理并储存在低温环境中，以防止血液的自发凝固。测试前，应使血液样品恢复至室温。如果血液样品为当时采集，可以直接使用。测试时，首先将血液样品进行稀释，然后在血液样品中加入凝血测试试剂并均匀分散。血液的凝血过程由压电谐振器表面所沉淀的碳酸钙进行激活，因此凝血测试试剂中不应含有钙离子。为保证测试准确，滴入的混合液体的最小体积应完全覆盖压电薄膜谐振器的上表面电极，最大体积不超过电极外围的环形凹槽106。

本实施例中，对血浆样品进行凝血酶原时间的测量。该血浆样品事先使用3.8％的枸橼酸钠溶液，按照1:9(枸橼酸钠溶液：血浆)的比例进行抗凝处理。测量前，进一步采用氨丁三醇缓冲液对抗凝血浆进行稀释，血浆与氨丁三醇缓冲液的比例为1:3。滴入样品的具体操作过程为：取5微升稀释血浆样品和5微升凝血酶原时间测试试剂进行充分混合并摇匀，然后取1微升混合液体滴入压电谐振器环形凹槽106中央。

步骤B，持续测量压电薄膜谐振器的谐振频率。

具体实施中，压电薄膜谐振器的谐振频率可以采用多种方法进行测量，如将器件与网络分析仪或阻抗分析仪连接进行频率测量；或设计与器件匹配的谐振电路和鉴频电路进行频率测量；或采用两个或多个压电薄膜谐振器进行差频法测量。本实施例中，采用两个相同的已做以上处理的压电薄膜谐振器分别作为传感器件和参考器件，同时接入测试电路中。测试中，只有传感器件负载血液样品，参考器件空载。两谐振器通过相同的谐振电路驱动，两个谐振频率经混频后进行滤波、放大、波形转换和分频，输出传感器件和参考器件的频率差值，最大程度上减少外界环境干扰。

步骤C，根据所记录的稳定后的压电薄膜谐振器谐振频率，计算谐振频率对时间变化的二阶导数，取该二阶导数的最高值作为凝血时间。

本实施例中，如图3所示的滴入混合液体样品后的压电薄膜谐振器谐振频率随时间的变化曲线。在滴入后，由于混合液体的冲击作用，谐振频率发生较大波动。因此，取4秒之后的数据作为有效数据进行分析。压电薄膜谐振器谐振频率随时间的变化呈现明显的三个阶段。第一阶段，谐振频率基本保持稳定，对应于凝血酶原转变凝血酶的反应过程；第二阶段谐振频率快速下降，对应于血液中纤维蛋白原转变为纤维蛋白单体，并最终互相交联形成凝块的过程；第三阶段，谐振频率长时间不变，说明凝血过程结束，血液已经完全凝固。

在凝血时间的测试中，关键需要确定血液样品凝血过程完成的时间点。经过反复的实验论证发现，以谐振频率对时间变化的二阶导数的最高值最接近实际的凝血时间，因此本发明提出以谐振频率对时间变化的二阶导数的最高值作为凝血时间。本实施例中，如图4所示为谐振频率对时间变化的二阶导数，可以得到凝血酶原时间为41.5秒。

为进一步阐述本发明的使用方法及有效性，采用本发明方法和常规凝血仪分别对多个血浆样品进行测量对照，结果如图5所示。图中三组不同凝血时间对应的血浆样品的稀释比例(血浆：氨丁三醇缓冲液)分别为1:1、1:3和1:5。可以看到，回归方程的斜率接近于1，截距仅为约0.5秒，决定系数(R2)的值为0.9837，说明本发明方法和常规凝血仪获得的结果具有较好的相关性和一致性。

本发明中未述及的部分采用或借鉴已有技术即可实现。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明的精神所作的举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。