一种乳腺癌特异性的热休克蛋白复合物及其应用
【专利说明】
[0001]本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一类能有效激活乳腺癌特异性T细胞的热休克蛋白复合物以及制备方法及其在治疗和预防乳腺癌中的应用。
技术背景
[0002]肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，乳腺癌对妇女的生命健康的威胁尤为严重。现全世界每年乳腺癌发病已达到130万例，乳腺癌与宫颈癌一起被称为女性“双癌”疾病。近年来随着分子生物学、细胞生物学、遗传学和免疫学等研究的不断进展，乳腺癌治疗已形成在传统的手术和放化疗基础上，结合内分泌治疗和生物治疗的综合治疗体系。
[0003]人源化抗体Trastuzumab (赫塞汀)革E向Her_2，通过介导细胞毒作用杀伤肿瘤细胞、阻断信号通路、抑制肿瘤细胞生长，取得了很好的治疗效果。目前赫塞汀己成为乳腺癌等治疗的一线药物。uPAR (Urokinase plasminogen activator receptor)，表达于细胞表面，能够引起胞外基质的降解，从而在肿瘤的转移中发挥重要作用。68%的侵染性乳腺癌组织表达uPAR，并且抑制uPAR的表达可以增强HER-2抗体的抑增殖效果。EGFR (表皮生长因子受体)在多种恶性肿瘤组织中表达显著增高，在临床上应用EGFR的抗体可以显著减少癌细胞表面EGFR的水平发挥治疗效果。在乳腺癌患者中有接近一半的癌患者肿瘤组织过表达EGFR。现在已经出现针对这些乳腺癌相关抗原的靶向治疗方案。但是T细胞活化是肿瘤治疗最关键的因素，目前却没有很好的针对这些靶点的乳腺癌T细胞治疗方案。
[0004]gp96是热休克蛋白HSP90家族中的重要成员，主要定位于内质网腔(EndoplasmicReticulum)，在正常组织和肿瘤中均有广泛表达。正常情况下gp96在细胞中呈低水平表达，而热休克、葡萄糖缺乏、细菌和病毒感染等均可增加其表达。gp96分子具有多肽结合的能力，能结合5-25个氨基酸的多肽序列。热休克蛋白HSP78是细胞质中HSP70家族中的成员，分子量约78kDa。HSP78分子作为分子伴侣能与细胞中各种短肽结合。目前已证实gp96和HSP78分子可以结合多种组织特异性抗原多肽，包括泡状口炎病毒抗原区肽、小鼠H-2Kb限制的卵清蛋白抗原表位肽、H-2La限制的白血病表位肽、乙肝病毒抗原肽等。
[0005]在细胞外，gp96可作为呈递分子将结合的短肽呈递给I类MHC分子，激活特异性和记忆性T细胞，引发机体细胞免疫反应。因此HSP本身不具备抗原性，所结合的短肽决定了 HSP复合物的抗原性。gp96还可以活化树突细胞(DC)促进MHC I类和MHC II类分子以及共刺激因子的表达，从而增强免疫反应。
[0006]肿瘤自体gp96复合物因为携带有患者自身肿瘤的抗原肽，可以激活患者个体特异性的T细胞反应杀伤肿瘤细胞，目前已成功应用于黑色素瘤、神经胶质瘤等的临床治疗。而乳腺癌相关的临床应用未见报道。
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【发明内容】
[0008]因此，本发明要解决的技术问题是筛选能激活乳腺癌特异性T细胞的肽段。克服肿瘤细胞免疫编辑导致的低免疫原性，能够在健康个体及乳腺癌患者中诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(杀伤性T细胞，CTL)，而且CTL具有强大的抗乳腺癌作用，对正常细胞及组织无破坏作用。
[0009]本发明的一个目的是提供一种与gp96和HSP78结合的乳腺癌抗原的复合物。所述的乳腺癌抗原可以分别是乳腺癌肿瘤抗原Her-2蛋白上第635-643位的氨基酸序列，其序列可以是VVLGVVFGI，或其变异序列；乳腺癌肿瘤抗原EGFR蛋白上第28-36位的氨基酸序列，其序列可以是KLKDPELSL，或其变异序列；乳腺癌肿瘤抗原uPar蛋白上第52-60位的氨基酸序列，其序列可以是RLWEEGEE，或其变异序列；乳腺癌肿瘤抗原uPar蛋白上第80-88位的氨基酸序列，其序列可以是RTGLKITSL，或其变异序列；乳腺癌肿瘤抗原uPar蛋白上第87-95位的氨基酸序列，其序列可以是SLTEVVCGL，或其变异序列；乳腺癌肿瘤抗原uPar蛋白上第107-115位的氨基酸序列，其序列可以是VTYSRSRYL，或其变异序列；乳腺癌肿瘤抗原uPar蛋白上第144-152位的氨基酸序列，其序列可以是CLDVVTHffI，或其变异序列。
[0010]本发明的复合物既包括热休克蛋白以非共价键与多肽结合形成的复合物，又包括热休克蛋白以共价键与多肽结合形成的复合物。本发明提供了制备本发明的如上所述抗原多肽与热休克蛋白gp96和HSP78的复合物的方法。
[0011]本发明所诉表位肽可以单独或以热休克蛋白复合物形式在HLA-A2转基因小鼠中诱导形成特异性的CTL。
[0012]本发明所诉表位肽可以在体外单独或以热休克蛋白复合物形式刺激HLA-A2阳性乳腺癌患者PBMC分泌IFN- γ，且这种作用在自体gp96免疫后显著增强。
[0013]本发明所诉表位肽可以单独或以热休克蛋白复合物形式提高HLA-A2阳性乳腺癌患者特异性T细胞反应。
[0014]本发明所述特异性CTL的诱导可以被Treg细胞抑制剂增强。
[0015]我们首次从五例Her-2阳性乳腺癌肿瘤组织中纯化的热休克蛋白gp96复合物中分离出一特异9肽，经氨基酸序列分析为“VVLGVVFGI”，经查询发现该序列位于乳腺癌特异性抗原Her-2的635-643位，人工合成该序列并与体外表达的gp96蛋白组装，体外合成gp96-9肽复合物，将该gp96-9肽复合物免疫HLA-A2转基因小鼠，能刺激小鼠产生特异性细胞毒性T细胞(CTL)，且应用调节性T细胞的抑制剂可以增强gp96-9肽复合物的免疫效果2倍以上。实验结果表明gp96-9肽复合物可开发成为一种新型乳腺癌的治疗性药物。
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附图简要说明
图1.小鼠(BALB/chu A2+)的特异性CTL反应。以gp96-9肽复合物按0、1、3周的周期免疫小鼠，最后一次免疫3天后检测特异性细胞裂解率。效应细胞CTL对特异性靶细胞的裂解百分率以4小时标准51Cr释放法测定，效应细胞与靶细胞之比分别是10、25、50和100，图中裂解率为10只小鼠平均值。
[0017]图2.gp96_肽段I免疫的小鼠脾脏淋巴细胞可抑制裸鼠皮下接种的乳腺癌细胞的生长。裸鼠腋下皮下接种人乳腺癌细胞SK-BR-3，荷瘤14天后转输不同来源的小鼠脾脏淋巴细胞。抗原肽I组(n=20)接受经过gp96-抗原肽I复合物免疫的BALB/c HUA2+小鼠的脾脏淋巴细胞；无关肽对照组(n=20)接受经过gp96-无关肽(HBcAg87-95)复合物免疫的Balb/c HLA A2+小鼠的脾脏淋巴细胞。
[0018]图3.小鼠(BALB/chu A2+)的特异性CTL反应。以Her_2阳性或者Her_2阴性的乳腺癌患者肿瘤组织来源gp96抗原复合物按0、1、3周的周期免疫小鼠，最后一次免疫3天后检测9肽特异性T细胞的变化。以IFN- γ的ELISP0T方法检测小鼠脾脏淋巴细胞中9肽特异性T细胞。无关肽HBcAg829。肽为阴性对照。结果显示只有Her-2阳性乳腺癌患者来源的gp96抗原复合物能激活9肽特异性的T细胞，表明复合物中包含相关的抗原。
[0019]
图4.乳腺癌患者免疫自体肿瘤gp96复合物后9肽特异性T细胞的变化。以IFN- γ的ELISP0T方法检测患者外周血中9肽特异性T细胞。无关肽HBcAg82 9。肽为阴性对照。
[0020]【具体实施方式】:
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0021]实施例1.从乳腺组织中纯化gp96蛋白
将Her-2+乳腺癌组织或者Her_2乳腺癌组织匀浆后离心，用30%/70%饱和度(順4)2304沉淀，沉淀溶解后采用ConA SepharoseCGE公司)进行亲和层析，用8%的α -甲基葡萄糖苷洗脱结合的蛋白，糖苷洗脱液以Hitrap-Q (GE公