司层析系统)进行阴离子层析，经过这三步纯化获得>95%纯度的gp96蛋白。gp96蛋白用gp96/grp94单克隆抗体(SantaCruz公司)进行Western鉴定。其纯度用SDS-PAGE、银染和反相HPLC鉴定。
[0022]
实施例2.从gp96蛋白释放非共价结合的多肽
将纯化的gp96蛋白加入三氟乙酸(TFA)使其终浓度达到0.2% (pH约2.0)，然后用超滤法(分子截留为30 kDa, Millipore公司)分离多肽，将多肽混合物进行MALD1-T0F质谱(ABI 4700)分析，多肽分子量大多在600-1200 Da之间。
[0023]
实施例3.反相HPLC分析多肽
多肽混合物冻干后溶于溶液A(0.065% TFA, 2%乙腈)，反相层析柱C18上样(S^hasilpeptide C18 ；5 11111粒度；4.6 X 250mm, GE 公司)，从 O 至 65% 溶液 B (0.05% TFA，100% 乙腈)进行梯度洗脱，流速为I mL/min，用214nm波长检测。比较Her_2+与Her_2肿瘤组织HPLC图谱，发现一个Her-2+组织共有而Her_2组织中没有的肽峰。
[0024]
实施例4.多肽微量测序与序列分析
收集该特异肽峰用MALD1-T0F质谱(ABI公司4700系统)鉴定其纯度，只发现分子量为1015 Da的单一峰。对该肽微量测序(Procise 491.蛋白测序仪，ABI公司)，其氨基酸序列为“VVLGVVFGIL”，5份肿瘤组织得到的序列一致。在蛋白数据库中查询该序列(NCBI)，发现它位于Her-2蛋白的635-643位。
[0025]
实施例5.gp96蛋白与人工合成的多肽体外快速组装
人工合成9肽“VVLGVVFGI” (委托吉尔生化有限公司合成)，将gp96蛋白与多肽进行体外组装，体外结合反应体系:
2.7 mmol/L KCl, 1.47 mmol/L KH2PO4,8.1 mmol/L Na2HPO4,138mmol/L NaCl, 10%(V/V)甘油，3.0 mmol/L 9肽，0.421 mmol/L gp96蛋白，60°C反应10分钟，超滤法(截留分子量30 kDa，Millipore公司)去除未结合的多肽。
[0026]
实施例6表达乳腺癌抗原肽I和热休克蛋白gp96的融合蛋白本实例提供了乳腺癌抗原肽I (VVLGVVFGI)与热休克蛋白gp96以共价键形成的融合蛋白的方法。我们人工合成互补的核酸序列(5 ‘ GATCC GTGGTCTTGGGGGTGGTCTTTGGGATC A3’及 5 ‘ GATCT GATCCCAAAGACCACCCCCAAGACCAC G 3 ‘)，并通过复性获得双链 DNA 片段，核酸序列对应于该肽的氨基酸序列，同时还在序列的5 ‘端引入限制性酶切位点BamH I粘性末端，3端引入限制性酶切位点Bgl II的粘性末端，获得粘性片段I。我们通过PCR在gp96的基因两端分别引入限制性酶切位点Bgl II和Xho I，限制性酶切获得粘性片段2。我们酶切真核表达载体pSeCTag2/Hygr0 A获得BamH 1、XhoI双切的粘性片段3。将3个DNA片段用T4连接酶连接，将抗原肽-gp96表达框插入到表达载体pSecTag2/Hygro A0将基因工程载体pSecTag2 /HygroB-Seql-hgp96通过电穿孔的方式转染CHO细胞，以潮霉素B抗生素筛选阳性克隆，并通过ELISA检测培养上清中的gp96获得高产细胞株。
[0027]
实施例7.免疫小鼠
选择出生8-10周的HLA-A2转基因的BALB/c小鼠(HLA_A2+)用于本实验。
[0028]免疫采用皮下免疫方式，部位为颈部，体积lOOuL，溶剂为PBS。同时在每次免疫前I天腹腔注射0.4 mg的环磷酰胺。低剂量环磷酰胺可以抑制在gp96免疫中起抑制作用的Treg细胞从而能增强免疫效果。
[0029]gp96蛋白-9肽复合物的最适免疫剂量为0.1 nmol。
[0030]免疫时间为0、1、3周进行三次的强化免疫，优于免疫一次或二次的效果。
[0031]免疫操作:将乳腺癌组织来源的gp96复合物及gp96_9肽复合物溶于PBS中，注射前充分混匀。免疫剂量，gp96-9肽复合物剂量为0.1Onmolo肿瘤gp96的免疫剂量为25ug。采用颈背皮下注射，第一次免疫I周后进行第二次免疫，2周后加强免疫，3天后进行T细胞活性检测。
[0032]
实施例8.细胞毒性(CTL)分析
小鼠加强免疫3天后，从每只小鼠收获得约3 X 17脾脏淋巴细胞悬于含有10 mMHEPES缓冲液、5 X 15 M巯基乙醇，抗生素和10% (V/V) FCS培养液中，于培养瓶中与经幅射(4500 Rad)的T2细胞(3:1)和lug/mL肽在完全培养基中37°C培养。6天后收集脾细胞进行4小时标准51Cr释放实验(具体方法见Kuhrober, A, et al.1997.1nternat1nalImmunology, 9 (8): 1203-1212)测定细胞毒性活性。简而言之，革E细胞用lOug/mL抗原肽或无关肽于37V致敏30分钟后加入不同数量的效应细胞，反应体系为100uL的完全培养基。37°C共培养4小时后收集上清测定特异裂解率。
[0033]从51Cr释放实验可以看出gp96_9肽复合物可刺激小鼠产生特异性细胞毒性T细胞，细胞毒性测定靶细胞的裂解率在50%以上，通过注射环磷酰胺的预处理可以明显的提高gp96-9肽复合物的免疫效果，且这种细胞毒效应是表位肽特异性的(图1)。实验结果表明gp96-9肽复合物可开发成为一种新型抗乳腺癌的治疗药物。
[0034]
实施例9细胞转输体内抑瘤实验
以gp96-乳腺癌抗原肽I免疫HLA-A2转基因小鼠获得抗原肽I特异性的脾脏淋巴细胞。将SK-BR3 (HLA-A2+/HER-2+)细胞接种于Balb/c (nu/nu)腋窝皮下准备乳腺癌荷瘤小鼠，在接种第14天时开始接受小鼠脾脏淋巴细胞转输。实验组荷瘤小鼠接受肽特异性淋巴细胞转输(?) (n=20);对照组小鼠转输免疫gp96-无关肽的小鼠淋巴细胞(■) (n=20)，每周转输一次，共3周。检测肿瘤大小，如图所示转输gp96-乳腺癌抗原肽I复合物免疫小鼠的淋巴细胞可明显抑制人乳腺癌细胞的生长(图2)。
[0035]
实施例10乳腺癌患者免疫自体gp96复合物治疗肿瘤
该研究中入组的乳腺癌患者需完成10个疗程的gp96免疫治疗。一周为一个疗程，每个疗程注射一次。试验组在术后8周内开始自体gp96免疫治疗。
[0036]操作流程
i患者入选:初发可根治性切除的乳腺癌患者。
[0037]ii肿瘤组织中gp96_肿瘤抗原复合物的纯化
按照孟颂东等发表的三步法(Meng S，Song J, Rao Z, Tien P, Gao G.2002.Three-step purificat1n of gp96 from human liver tumor tissues suitable forisolat1n of gp96_bound peptides.Journal of Immunological Methods, 264(1-2):29-35.)对肿瘤组织中gp96蛋白进行提取纯化，通过ConA柱亲和层析结合Hitrap Q柱离子交换方法纯化得到纯度95%以上gp96蛋白。
[0038]考马斯亮蓝显色法测定蛋白浓度，每份样本的蛋白提取量应能满足10个疗程的治疗需要。
[0039]微生物检测，应满足对蛋白疫苗制品的要求(参照生物制品规程)。
[0040]内毒素检测，应满足对蛋白疫苗制品的内毒素含量要求(鲎试剂法)。
[0041]iii gp96-肿瘤抗原复合物的使用
患者在手术后