一种用于血管钙化诊断的血浆标志物、引物对、试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域，具体涉及一种用于血管钙化诊断的血浆标志物、引物 对、试剂盒及应用。
【背景技术】
[0002] 血管|丐化（Vascular calcification)是糖尿病、高血压、动脉粥样硬化性血管病 变及其他血管损伤等疾病普遍存在的病理改变，是心脑血管疾病高发病率及高死亡率的重 要因素之一，甚至被认为是一个精确预测心血管不良事件的指标。以往认为血管钙化是钙 盐在细胞内及细胞外基质的被动沉积。然而，近年发现血管钙化是一个主动的、高度可调的 生物学过程，其过程类似于骨形成。血管平滑肌细胞作为心血管系统主要的构成细胞，其由 收缩表型向成骨细胞样表型转变，是血管钙化发生、发展的关键病理过程。目前临床上对于 血管钙化尚缺乏安全有效的治疗方法。通过冠脉造影术和双能源CT扫描技术等影像学检 测方法确认血管钙化病灶时，患者的血管钙化情况一般已经较为严重，不易根治，且费用较 为昂贵。即使新近发展起来的旋磨切除术或切割球囊血管成形术对已形成的钙化病灶进行 治疗的效果也不甚理想。因此，寻找有效、特异的早期诊断指标及治疗靶点，对临床及时预 防和治疗血管钙化具有重要意义。
[0003] 微小RNA(microRNA，miRNA)是长度约18~22个氨基酸的小分子非编码调控 RNA，它通过与靶基因 mRNA的:T端非编码区^ UTR)相互配对结合，降解靶mRNA或 者阻遏靶mRNA的翻译，从而在转录后水平负调控靶基因的表达。由于血管钙化与骨形 成有相似的机制，同时与血管的氧化应激、血管损伤、血管平滑肌表型改变、血脂代谢的 异常及动脉粥样硬化等密切相关，故认为参与调节血管损伤、血管平滑肌表型改变及动 脉粥样硬化的miRNA，尤其是调节骨形成的miRNA极可能参与血管钙化的发生。此外， Chen等的研究已初步证实miRNAs可作为糖尿病等疾病的血衆生物学标志物（Chen X，et al, Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res, 2008, 18(10) :997-1006)，这也使血 浆miRNAs作为疾病的诊断标记分子应用于临床成为可能。
[0004] 研究表明miR-32_5p在调节骨再生方面具有重要作用（Palmieri A, et al，Medpor regulates osteoblast's microRNAs [J]· Biomed Mater Eng, 2008. 18 (2): 91-97)，它在血 管钙化过程中可能同样起到关键性作用。目前尚无将血浆miR-32-5p作为血管钙化相关标 志物的报道，我们首先发现miR32-5p在血管钙化血浆中的高表达，可以为开发试剂盒作为 临床依据。如果能检测出miR-32-5p在血管钙化患者血浆中的显著性表达差异，将对血管 钙化的临床早期诊断和治疗产生重要的指导价值。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种用于血管钙化诊断的血浆标志物、弓丨 物对、试剂盒及应用。
[0006] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0007] 所述用于血管钙化诊断的血浆标志物为miR-32-5p，序列如SEQ ID NO. 1所示，该 标志物可用于制备血管钙化诊断试剂。
[0008] 检测上述标志物的引物对包括miR-32-5p的PCR正向引物和PCR通用反向引物； 所述miR-32-5p的PCR正向引物序列如SEQ ID NO. 2所示，所述PCR通用反向引物序列如 SEQ ID Nd 3 所示。
[0009] 血管钙化诊断试剂盒中含有权利要求2所述的引物对。优选地，所述试剂盒中还 含有内参miR-16的PCR正向引物；所述内参miR-16序列如SEQ ID NO. 4所示，所述内参 miR-16的PCR正向引物序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0010] 检测上述标志物的方法包括如下步骤：
[0011] (1)提取 miRNA ;
[0012] (2)将 miRNA 逆转录成 cNDA ;
[0013] (3)用上述试剂盒对cDNA进行扩增；
[0014] (4)通过溶解曲线和扩增曲线分析，2 AACT法进行miR-32-5p的相对定量。
[0015] 发明人通过对比分析血管钙化患者及非钙化对照组血浆中的miR-32-5p的含量 差异，发现miR-32-5p在血管钙化患者血浆中的含量明显高于对照组血浆，表明miR-32-5p 与血管钙化呈正相关，以miR-32-5p含量水平为区分标准，可以进一步开发用于血管钙化 诊断的检测试剂盒，为早期诊断血管钙化提供临床依据。
[0016] 本发明首次对血管钙化具有特异筛查价值的生物标记物miR-32_5p，发现血浆 miR-32-5p检测可以用于血管钙化患者诊断；通过血管钙化相关的血浆标志物miR-32-5p 和诊断试剂盒的开发和应用，可以快速诊断血管钙化病情并及时有效治疗，也为发掘新型 有效的小分子药物靶标提供科学依据。
【附图说明】
[0017] 图1为血管钙化患者与非钙化对照组血浆中miRNA表达水平比较。
[0018] 图2为血管钙化患者与非钙化对照组血浆中miRNA表达水平ROC曲线。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1 :血浆miR-32-5p在血管钙化患者与非钙化对照组中的表达水平
[0020] 一、研究对象
[0021] 选择2013年6月至2014年5月间南华大学附属第一医院行冠状动脉冠脉造影术 和双源CTC检查确诊冠脉钙化的患者66例。排除既往有心肌梗死病史，冠状动脉或外周动 脉血运重建病史者，肝肾功能不全、甲状腺或肾上腺功能紊乱，钙代谢异常，慢性感染（活 动性结核、COPD迀延期）、结缔组织病、肿瘤、免疫系统疾病或精神病及其他疾病的终末期 等。根据冠脉CTA的Agatston法积分（CACS)分为冠脉钙化组与对照组，其中冠状动脉钙 化积分等于0分患者即非冠脉钙化组33例，而冠状动脉钙化积分大于0分患者33例。
[0022] 研究过程中所涉及的资料收集及血样采集均在研究对象知情同意下进行。
[0023] 二、研究方法
[0024] L血浆收集
[0025] 所有纳入观察的患者均于术时抽动脉血约3ml置于IOml EDTA-K2抗凝管。标本 采集后静置30分钟后，3000rpm离心10分钟取上清液血浆分装于EP管，置于-70°C低温 保存血浆。
[0026] 2.采用miRNA提取分离试剂盒提取血浆中miRNA (miRNA提取试剂盒购自天根生化 科技有限公司，货号：DP501)
[0027] (1)取200ul血浆加入等体积裂解液，振荡器振荡混匀30秒。室温放置5分钟。 室温12000rpm离心10分钟，吸取上清转移到新管中。
[0028] (2)加入200ul氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置5分钟，取水相转移至新管中。