r>[0029] (3)量取转移液，加入转移液体积1/3的无水乙醇，混匀。将得到的溶液和沉淀 一起转入吸附柱miRspin，室温放置2分钟，室温12000rpm离心30秒，离心后弃掉吸附柱 mi Rsp i η，保留流出液。
[0030] (4)量取流出液，缓慢加入流出液体积2/3体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液 和沉淀一起转入吸附柱miRelute，室温放置2分钟，室温12000rpm离心30秒，离心后弃掉 流出液，保留吸附柱miRelute。
[0031] (5)向吸附柱miRelute中加入500ul去蛋白酶MRD，室温静置2分钟，室温 12000rpm离心30秒，弃废液。
[0032] (6)向吸附柱miRelute中加入600ul漂洗液RW，室温静置2分钟，室温12000rpm 离心30秒，弃废液。
[0033] (7)重复步骤（5)。
[0034] (8)将吸附柱miRelute放入2ml收集管中，室温12000rpm离心1分钟，弃废液。
[0035] (9)将吸附柱miRelute转入一个新的RNase-Free I. 5ml离心管中，加入20ul RNase-Free双蒸水，室温静置2分钟，室温12000rpm离心2分钟，收集得到纯净的miRNA。
[0036] 3.采用Mir-X?miRNA第一链合成试剂盒（试剂盒购自TAKARA公司，货号638313)
[0037] (1)在冰上预冷RNase Free的反应管内加入以下试剂至总体积IOul
[0039] (2)移液器轻轻混匀上述配制的反应液，37°C反应60分钟，接着85°C反应5分钟， 在所得的反应液中加入90 μ 1双蒸水，即得到所需cDNA。
[0040] 4.荧光定量PCR反应按照Mir-X?miRNA qRT-PCR :§￥碰_试剂盒说明书进行（试 剂盒购自TAKARA公司，货号：638314)
[0041] (1)荧光定量PCR反应体系配制
[0042] CN 105177147 A 说明书 4/5 页
[0043] (2)扩增反应程序设置如下：
[0044] Stage 1 :预变性
[0045] 95 cC 10 秒
[0046] Stage 2 :PCR 反应（40 个循环）
[0047] 95 cC 5 秒
[0048] 60 cC 20 秒
[0049] Stage 3 :溶解曲线分析
[0050] 95 cC 60 秒
[0051] 55 cC 30 秒
[0052] 95 cC 30 秒
[0053] 以SYBR Green作为荧光标记物，在ABI荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。 扩增 miR-32-5p 的正向引物序列如 SEQ ID NO. 2(GGCGGCGGTA TTGCACATTA CTAA)所示， miR-32-5p的序列如SEQ ID NO. l(UAUUGCACAUUACUAAGUUGCA)所示，反向引物为通用反向引 物，通用反向引物序列如 SEQ ID NO. 3(GCGCAATGCA TCGCATAGCA ACTGT)所示。以 miR-16 作为内参基因，内参miR-16序列如SEQ ID NO. 4 (UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG)所示，内参 miR-16 的PCR正向引物序列如 SEQ ID NO. 5(GCGGCGGTAG CAGCACGTAA ΑΤΑ)所示，反向引物 为SEQ ID NO. 3所示的通用反向引物。
[0054] 5.研究结果与分析
[0055] 采用实时荧光定量PCR测得的血浆miR-32-5p的表达量，用Ct32 5p表示，miR-16 的表达量用Ct16表示。血浆miR-32-5p的相对表达量=2 - ΔΛ' [Δ ACt = (Ct32 5p-Ct16) 血管im-(ct32 5Ρ - Ct16)对照]。结果如附图1所示，与非钙化对照组相比，血管钙化患者血浆中 miR-32-5p的含量明显增高，差异具有统计学意义（Ρ〈0. 05)。miRNA引物探针信息及目标序 列如表1所示：
[0056] 表1. miRNA引物探针信息及其成熟序列
[0057] CN 105177147 A ^ "n \J b/b 贝
[0058] 实施例2 :miR-32-5p对血管钙化患者的诊断效果评价
[0059] ROC曲线分析显示，miR-32-5p作为生物标记物对血管钙化具有较高诊断价值 (AUC为0. 831)，详细分析结果见表2。
[0060] 表2 :R0C分析结果
[0062] 实施例3 :血管钙化诊断试剂盒
[0063] 检测血浆miR-32_5p含量的血管钙化诊断试剂盒组成如表3所示：
[0064] 表3血管钙化诊断试剂盒的组成
[0066] 表3中，用于血管钙化诊断的试剂盒中miR-32-5p的PCR正向引物序列如SEQ ID NO. 2所示，miR-16的PCR正向引物序列如SEQ ID NO. 5所示；相应PCR技术所需的常用试 剂，如：逆转录酶，逆转录缓冲液，SYBR预混物，ROX染料，RNase-Free双蒸水等，都是本领域 技术人员熟知的；另外还可以含有标准品和对照品。
【主权项】
1. 一种用于血管钙化诊断的血浆标志物，其特征在于，所述标志物为miR-32-5p，序列 如SEQIDNO. 1 所示。2. -种检测权利要求1所述标志物的引物对，其特征在于，所述引物对包括miR-32-5p 的PCR正向引物和PCR通用反向引物；所述miR-32-5p的PCR正向引物序列如SEQIDNO. 2 所示，所述PCR通用反向引物序列如SEQIDNO. 3所示。3. -种血管钙化诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求2所述的引物 对。4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有内参miR-16的PCR 正向引物；所述内参miR-16序列如SEQIDNO. 4所示，所述内参miR-16的PCR正向引物序 列如SEQIDNO. 5所示。5. 权利要求1所述的标志物在制备血管钙化诊断试剂中的应用。6. -种检测权利要求1所述标志物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： (1) 提取miRNA; (2) 将miRNA逆转录成cNDA; (3) 用权利要求4所述的试剂盒对cDNA进行扩增； (4) 通过溶解曲线和扩增曲线分析，2AACT法进行miR-32-5p的相对定量。
【专利摘要】本发明公开了一种用于血管钙化诊断的血浆标志物、引物对、试剂盒及应用。本发明公开了用于血管钙化诊断的血浆miRNA标志物miR-32-5p。该标志物及其引物可用于制备诊断试剂盒，用于血管钙化的临床诊断及预防检测。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105177147
【申请号】
【发明人】刘江华, 祖旭宇
【申请人】南华大学附属第一医院
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月22日