检测乙型肝炎病毒的引物对和荧光探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测病毒的引物对和荧光探针及试剂盒，尤其是涉及一种检测乙 型肝炎病毒的引物对和荧光探针及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎病毒（HBV)是一种有包膜的双链DNA病毒，属于嗜肝病毒科。乙型肝炎 病毒（HBV)属嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae)，基因组长约3. 2kb，为部分双链环状DNA。 HBV侵入人体后，与肝细胞膜上的受体结合，脱去包膜，穿入肝细胞质内，然后脱去衣壳，部 分双链环状DNA进入肝细胞核内，在宿主酶的作用下，以负链DNA为模板延长正链，修补正 链中的裂隙区，形成共价闭合环状DNA(cccDNA)，然后以cccDNA为模板，在宿主RNA聚合酶 Π 的作用下，转录成几种不同长短的mRNA，其中3. 5kb的mRNA含有HBVDNA序列上全部遗 传信息，称为前基因组RNA。后者进入肝细胞质作为模板，在HBV逆转录酶作用下，合成负 链DNA，再以负链DNA为模板，在HBV DNA聚合酶作用下，合成正链DNA，形成子代的部分双 链环状DNA，最后装配成完整的HBV，释放至肝细胞外。胞质中的子代部分双链环状DNA也 可进入肝细胞核内，再形成cccDNA并继续复制。cccDNA半衰期长，很难从体内彻底清除。
[0003] 各型急性、慢性乙肝患者和HBsAg携带者均可作为传染源。HBV存在于血液和体 液中。急性患者从发病前数周至整个急性期内均有传染性，是乙肝的重要传染源。慢性乙 肝病人常携带HBV，且反复发作，也是乙肝的重要传染源。HBsAg携带者是指血液HBsAg阳 性，但无肝炎症状和体征，肝功能检查正常，经半年观察无变化者。在我国人群中，HBsAg携 带者的比例较高，因此，他们是更重要的传染源。
[0004] 我国是乙型肝炎高发区，堪称"肝炎大国"。根据卫生部2002年统计资料显示，我 国乙型肝炎的现患率为277/万，是美国的40多倍，年发病率为95/万。在法定传染病中，其 发病率仅次于感染性腹泻与流行性感冒而居第三位。流行病学调查表明，我国至少有8亿 人感染过乙型肝炎，而我国人群中的乙肝表面抗原的携带率高达10. 34%，也就是说，约有 1. 3亿人为乙肝病毒携带者，几乎占全世界总数的一半，他们中的四分之一最终将发展成慢 性肝炎、肝硬变或原发性肝癌。此外，全国还有1200多万的慢性肝炎病人，每年死于肝病者 达30万之多，其中约半数为肝癌。更为严重的是，有40%携带乙肝表面抗原的母亲，将通过 母婴垂直传播，使80~90%的新生儿（每年约80~90万人）成为慢性乙肝病毒携带者。
[0005] 2. I. 1乙型肝炎血清检测项目
[0006]目前国内多数医院开展的乙型肝炎血清检测项目有以下几种：
[0007] 乙肝五项（又称乙肝二对半）：检查乙型肝炎患者血清里的乙肝病毒抗原抗体。
[0008] 前S2抗原/抗体：1992年日本学者用血凝法发现在乙肝患者血液中有一种物质 能和聚合人血清白蛋白（PHSA)结合，即称之为聚合血清白蛋白受体（PHSA.R)。进一步研 究证实，PHSA. R实质上是乙肝病毒外壳的一种成分，由于其编码基因位于乙肝表面抗原 (HBsAg)基因的前方，故称之为前S抗原（pres)。前S抗原又分为两种，即前Sl(pre-Sl) 和前S2 (pre-S2)，PHSA. R即前S2。由于人的肝细胞表面也存在PHSA. R，因此，前S抗原可 能通过人血中存在的少量聚合白蛋白而同肝细胞结合，人侵肝细胞。临床资料证实，HBV活 跃复制时，pre_S2滴度增高，反之呈低滴度或阴性。急性乙肝时，若前S2消失早，抗前S2出 现早，则病人多数痊愈，反之则提示慢性化的可能。
[0009] HBV DNA :它是HBV的遗传物质。用分子杂交的方法或基因扩增的方法分别在肝细 胞内和血清中检出。肝内HBV DNA又分为肝细胞内游离型与肝细胞内DNA整合型两种。若 仅在肝内检出整合型HBV DNA，而在血清中和肝细胞内无游离型HBV DNA，说明肝内无 HBV 增殖，由于检测方法灵敏度高，故目前作为HBV增殖复制的判断指标优于DNA-P、HBeAg等的 检测。
[0010] DNA-P :它是1973年Kaplan首先检出的，如前所述它位于HBV的核心内，由于 DNA-P直接参与HBV复制，因此它与HBV DNA都被视为HBV复制的直接标志。因 DNA-P检测 方法较复杂，且灵敏度不如HBV DNA，故若仅为反映病毒复制及机体传染性强弱，就不一定 要选择DNA-P的测定。但它是考核某些治疗乙肝药物的良好指标，任何药物或消毒剂若能 抑制DNA-P的活性就意味着能抑制HBV的复制。
[0011] 2. L 2免疫学检测方法
[0012] 传统的HBV检测方法主要有血凝抑制试验、酶联免疫吸附试验（ELISA)、胶体金标 记试验和放射免疫（RIA)检测血清标本中的HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBc、抗HBe等五项 指标，特别是ELISA法检测肝炎病毒抗原、抗体，其灵敏度接近于RIA法，且不需要昂贵的仪 器，没有放射性污染，所以目前在国内外普遍应用。但ELISA法在对一些无症状HBV携带者 及血清病毒滴度很低的标本均有着一定程度的漏检。由于ELISA法检测血清学是表型指 标，只能提供体内HBV感染的间接证据，且敏感性只能达到0. 1 μ g/ml，难以准确反映体内 HBVDNA的存在状况。
[0013] 2. 1. 3 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR)
[0014] HBV DNA的检测是病毒感染最直接、最敏感和最特异的指标。随着分子生物学研究 技术的迅速发展，新近建立起来了聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR)法 检测HBV DNA。研究显示EB (溴乙锭）染色可检出Ifg HBV DNA，大约相当于三百个病毒的 基因组的拷贝。PCR-SBH(Southern印迹杂交法）可检出少至3份拷贝的HBV DNA，相当于 0.0 lfg水平，比斑点印迹杂交敏感10,000倍。用特异的HBV DNA探针可以证明PCR扩增产 物的特异性。而直接检测HBV DNA的核酸杂交法敏感性较低，只能检测到106个病毒颗粒 /ml血清标本。
[0015] 由于PCR法不受生物个体因素影响，具有高度灵敏度、特异性，具有简单、快速、易 于自动化等优点，可以进行单个或成批样品的检测，适合基层单位的推广，因而非常有希望 成为HBV DNA常规检测方法。
[0016] 2. L 4核苷酸序列测定
[0017] 核苷酸序列测定是判断HBV基因型的最为可靠的办法，且可以检测出多位点的变 异，其局限性在于很难识别混合型感染（突变病毒占30%时仍较难检测）。此外，耗时、费 力、检测结果分析的技术难度以及实验成本等诸多因素限制了其在大规模标本的临床检测 中的应用。
[0018] 2.1.5 DNA 杂交
[0019] DNA杂交技术可用于检测HBV基因型和耐药突变。根据放射性同位素和荧光分子 特异性探针的不同，可以发展多种DNA杂交技术。PCR和LightCycler试验的结合，可用于鉴 定耐药突变，但该方法会产生假阳性，且突变的病毒至少要占总数的5~10%时才能检测 至1J。利用线探针（line probe)，比利时的Innogenetics公司则开发了系列产品INNO-LiPA HBV DR、INNO-LiPA HBV PreCore 和 INNO-LiPA HBV Genotyping，用于鉴定 HBV 突变和基因 分型一。该方法的优点在于，当突变病毒只占总体的很少一部分时，INNO-LiPA方法即可检 测到，因而可用于HBV药物抗性突变的早期检测；其局限性则在于特异性受到限制，且在新 突变发生时，该方法需要更新。
[0020] 2. 1.6基因芯片
[0021] 基因芯片以大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作为探针