br>[0058] (2)对待测样品进行PCR反应；
[0059] 所述PCR反应的反应条件为：92~95°C条件下反应3~5分钟；然后92~95°C， 10~15秒，55~65°C，10~35秒，共35~45个循环；优选：94°C条件下反应4分钟；然 后94°C，15秒，60°C，35秒，共40个循环。
[0060] (3)通过荧光定量PCR仪检测反应结果。
[0061] 荧光定量PCR仪检测反应结果，采用荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为FAM 焚光素，焚光信号收集设在60 °C。
[0062] 荧光定量PCR仪检测反应结果，如果检测通道没有出现S型扩增曲线，判为HBV阴 性；如果检测通道出现S型扩增曲线，则判定为阳性，并利用HBV定量标准品检测所生成的 标准曲线计算待测样本的浓度（IU/ml)。
[0063] 作为本发明的优选技术方案，步骤（1)所述的磁珠法选自人工提取法或者核酸自 动提取仪提取法中的一种。
[0064] 所述核酸自动提取仪按照表1所示程序提前设置好，分别按照设置的参数执行裂 解、结合、洗液A清洗、洗液B清洗、洗液C清洗、洗脱。
[0065] 表1自动提取仪程序设置
[0067] 采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
[0068] 1、利用本发明的试剂盒可以快速、简便、高效、灵敏的对血液样本中乙型肝炎病毒 载量进行测试，因而能保证及时的病例诊治及治疗效果监测，适合于大规模临床开展。
[0069] 2、本发明的检测方法反应快速、敏感性高，一般1. 5到2小时即可得到反应结果， 并且成本低、无假阳性，最低检出可达到50copies/ml，适合于大规模临床开展，从而实现对 HBV的快速、有效且准确的定量检测；同时，本发明的检测方法的特异性很好，不和其他的 病毒发生交叉反应，例如丙肝病毒（HCV)，EB病毒（EBV)，人巨细胞病毒（HCMV)，人类细小病 毒 B19 (HPV B19)和 BK 病毒（BKV)。
【附图说明】
[0070] 图1是本发明的灵敏度曲线图；
[0071] 图2是人工提取16例样本的扩增曲线图；
[0072] 图3是自动提取仪提取16例样本的扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0073] 以下结合具体实施例和附图对本发明做进一步解释说明。
[0074] 将本发明所述的试剂盒稀释浓度后为200IU/mL，100IU/mL，50IU/mL，分别重复检 测4次，均可检出，最低可以检出50IU/mL，具体结果见图1，说明本试剂盒具有较高的灵敏 度。
[0075] 实施例1 :
[0076] 1.配置提取部分用的制剂盒
[0077] 所述试剂盒包括磁珠、蛋白酶K、助沉剂、裂解液、结合液、3种洗涤液、洗脱液。
[0078] I. 1蛋白酶K :将蛋白酶K干粉用DEPC水溶解至终浓度为10mg/mL。
[0079] L 2助沉剂：Carrier RNA溶液直接分装。
[0080] I. 3裂解液：由含4~5M异硫氰酸胍或盐酸胍、质量百分含量20 %~50%的乙醇 和质量百分含量 1%~20%表面活性剂（PEG6000、Chelex-100、TritonX-100)的 Tris-HCl 缓冲液配置而成。
[0081] 1. 4磁珠：娃羟基磁珠颗粒分装（20~200mg/mL)
[0082] 1. 5洗液A :含质量百分含量20%~50%乙醇，1~IOOmM盐酸胍或异硫氰酸胍的 Tris-HCl缓冲液配置而成。
[0083] 1. 6 洗液 B :DEPC Treated Water。
[0084] I. 7 洗液 C :pH 7· 0 ~9· 0 的 Tris-HCl 缓冲液。
[0085] 1. 8 洗脱液：DEPC Treated Water。
[0086] 2.制备HBV定量标准品
[0087] 将已灭活高HBV病毒载量血清样本由国家或企业参考品以荧光PCR方法进行定量 后，用已灭活阴性血清梯度稀释为 5 X IO6IlVml、5 X IO5IlVml、5 X IO4IlVml、5 X IO3IlVml、 5 X IO2IlVml 〇
[0088] 3.处理血浆/血清样本（含定量标准品）
[0089] 分别取定量标准品I~V，用来绘制标准曲线；
[0090] 1例阴性质控品、4例HBV血清样本、4例HBV血浆样本、2例健康人血清样本、1例 丙肝病毒（HCV)血清/血浆样本、1例EB病毒（EBV)血清/血浆样本、1例人巨细胞病毒 (HCMV)血清/血浆样本、1例人类细小病毒B19 (HPV B19)血清/血浆样本和1例BK病毒 (BKV)血清/血浆样本共计16例样本进行提取。
[0091] 3. L 1分别加入10 μ L蛋白酶Κ、4 μ L助沉剂、300 μ L裂解液，20 μ L磁珠（使用前 充分振荡混匀），加入200 μ L待处理样本，振荡混匀各离心管，室温颠倒混匀10分钟，使磁 珠和核酸充分结合。
[0092] 3. 1. 2将离心管放在磁力架上静置1分钟，磁珠吸附完全，溶液澄清后弃去上清 液，吸附在离心管盖上的磁珠可通过反复颠倒磁力架冲洗下来。
[0093] 3. 1. 3加入500 μ L洗液Α，漩涡振荡使磁珠重新悬浮，然后置于磁力架上，1分钟磁 分离后去上清。
[0094] 3. 1. 4加入500 μ L洗液Β，漩涡振荡使磁珠重新悬浮，然后置于磁力架上，1分钟磁 分离后去上清。
[0095] 3. 1. 5将离心管放置在磁力架上，缓慢加入550 μ L洗液C (不要冲起磁珠），静置 1分钟磁分离后弃去上清液，取下离心管。
[0096] 3. 1. 6加入50 μ L洗脱液，用移液器缓慢吹打混勾，50~80°C温育5~10分钟，期 间轻轻晃动溶液两次。
[0097] 3. 1. 7将离心管放在磁力架上静置1分钟，磁分离后将上清液转移至新的灭菌离 心管中。
[0098] 4.荧光PCR体系配置及荧光定量实验
[0099] 4.1引物与探针设计
[0100] 针对HBV基因组设计特异性引物SCORE-F和sCORE-R，Taqman荧光探 针sCORE-FP，Taqman荧光探针sCORE-FP的5'端标记的荧光基团是6-羧基荧光 素（6_carboxyfluorescein，FAM)，3'端标记的淬灭基团是黑洞淬灭剂l(Black Hole 911611(31161'1，13现1)，序列方向为5'-3'。
[0101] 4. 2乙型肝炎病毒PCR总反应液的配制：
[0102] PCR反应的反应体系包括：PCR反应液29 μ L、聚合酶1 μ L、待检模板20 μ L ;
[0103] PCR反应液按如下配置：10 X反应缓冲液5 μ L，sCORE-F (10 μ Μ) 2 μ L， sC0RE-R(10yM)2yL，sC0RE-FP(10yM)2yL，dNTP 6yL，最后用无菌超纯水将反应体系补 至 29 μ L ;
[0104] 取PCR反应液29 μ L、聚合酶1 μ L配制成反应体系，然后加入20 μ L待检模板；
[0105] 每批次反应均设置阴性质控品对照和乙型肝炎病毒定量标准品I -V，
[0106] 反应条件：94°C，4分钟；94°C，15秒；60°C，35秒，40个循环。
[0107] 采用Stratagene Mx 3000p荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为FAM荧光素， 荧光信号收集设在60 °C。
[0108] 5.结果判断：
[0109] 检测通道没有出现S型扩增曲线，判定为乙型肝炎病毒病毒阴性。
[0110] 检测通道出现S型扩增曲线，判定为阳性，并利用HBV定量标准品检