一种鸡新城疫弱毒株及其在制备鸡新城疫油乳剂灭活疫苗的应用
【专利说明】一种鸡新城疫弱毒株及其在制备鸡新城疫油乳剂灭活疫苗的 应用
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技术领域： 本发明涉及鸡新城疫的病原以及预防，特别是一种鸡新城疫弱毒株及其在制备鸡新城 疫油乳剂灭活疫苗的应用。
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【背景技术】： 新城疫(Newcastle Disease，ND)，又称亚洲鸡瘟、伪鸡瘟等，是发生于鸡、鸽、鹌鹑、火 鸡等家禽和野生禽类的一种急性、败血性和高度接触性传染病，是世界动物卫生组织(0ΙΕ) 规定的法定必报传染病之一。其病原是新城疫病毒(Newcastle Disease Virus JDVhNDV 属于副黏病毒科，副黏病毒亚科，聰腺炎病毒属(RubulavirusXNDV只有1个血清型，但通过 遗传发生分析，可将不同地区的流行毒株或疫苗株分成若干个基因型或抗原群。近年来，我 国流行的主要毒株属于NDV W、Vni、IX基因型，其中基因 W型是主要流行毒株。基因 W型包 括Wa、Wb、Wc、Wd、We 5个亚型，我国流行的主要是Wd、We亚型。新城疫不仅给家禽养 殖业带来严重的经济损失，而且还严重影响禽和禽类相关产品的国际贸易。因此，世界各国 对该病的发生流行均采取非常严格的防控措施。1990年代以来，我国新城疫在疫苗免疫鸡 群中的发生逐渐严重，主要特征是产蛋量大幅下降以及死亡率低、抗体滴度高，这种非典型 新城疫严重危害了鸡的生产性能，给养禽业造成了巨大损失。
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【发明内容】
： 本发明的目的是提供一种低致病力的鸡新城疫病毒，该病毒具有免疫原性好，安全的 特性。
[0004] 本发明的技术方案是，一种鸡新城疫弱毒株，藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，微生物保藏编号为CGMCC No. 11290。
[0005] 保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0006] 保藏日期:2015年10月19日。
[0007] 分类命名:鸡新城疫病毒。
[0008] -种鸡新城疫弱毒株在制备鸡新城疫弱毒活疫苗中的应用。
[0009] -种鸡新城疫弱毒株由其制备鸡新城疫油乳剂灭活疫苗的制备，步骤包括： (1) 以权力1要求所述的弱毒株为种毒，PBS缓冲液等量稀释后接种鸡胚尿囊腔，每胚 0.1-0.2mL，37 °C孵育，孵育96h后收获尿囊液，计量加入0.1%的甲醛溶液灭活，即得抗原液； (2) 以白油和Span-80按94:6的比例混合后，加2%的硬脂酸铝，搅拌至透明，高压灭菌即 得油相； (3) 抗原液和灭菌后的Tween-80按96:4比例混合，充分振摇，使Tween-80完全溶解，即 为水相； (4) 油相和水相按照2份:1份混合乳化，即油相2份注入胶体磨中，打开开关搅动油相， 同时缓慢加入水相1份，搅拌转速由慢到快充分乳化，即完成制备。
[0010] 本发明分离得到的毒株是一株免疫原性好、生产性能优良、适宜大规模生产的种 毒。由该毒株制备的活疫苗产品质量合格，具备产业化生产的条件。
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【具体实施方式】： 实施例1， (1) 以微生物保藏编号为CGMCC No. 11290的弱毒株为种毒，PBS缓冲液等量稀释后接种 鸡胚尿囊腔，每胚0.1-0.2mL，37 °C孵育，孵育96h后收获尿囊液，孵育96h后收获尿囊液，计 量加入0.1%的甲醛溶液灭活，即得抗原液； (2) 以白油和Span-80按94:6的比例混合后，加2%的硬脂酸铝，搅拌至透明，高压灭菌即 得油相； (3) 抗原液和灭菌后的Tween-80按96:4比例混合，充分振摇，使Tween-80完全溶解，即 为水相； (4) 油相和水相按照2份:1份混合乳化，即油相2份注入胶体磨中，打开开关搅动油相， 同时缓慢加入水相1份，搅拌转速由慢到快充分乳化，即完成制备。
[0012] 具体实例:病料采集及处理 病料来自河南省卫辉市某蛋鸡场，选择自然发病死亡6h内或频死鸡，无菌采集气管组 织块、肝脏、肾脏、脑，加10倍生理盐水，在研钵内反复研磨成乳剂，4000r/min离心10min，反 复2次。取上清液向其中按1 %的量加入双抗，于4 °C冰箱内过夜保存。
[0013] 2鸡胚接种及尿囊液的收集 无菌条件下，将上清液接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，接种量为0.2mL/胚。将接种的鸡 胚置37°C恒温箱孵育。每4h照蛋一次，将死亡鸡胚或垂死鸡胚取出置4°C冰箱保存，7d后将 所有鸡胚取出置于4°C冷却，收集尿囊液。重复传3代，收尿囊液4000r/min离心15min，收上 清液冷冻保存。
[0014] 3血凝特性测定 分别采集猪、兔、犬、绵羊、豚鼠、小鼠、山羊、鸡、人的〇型红细胞。将红细胞用生理盐水 制成1%的悬液。在V型血凝板上，每孔滴加 ros液(PH7.0)0.025mL，每孔分别滴加待检病毒 0.025mL，混匀后弃去0.025mL，之后每孔滴加1%( v/v)红细胞悬液0.025mL，每种动物红细胞 2个重复，置于微型混合器上振荡lmin，置于室温条件下（18 °C_20 °C )35min后，观察可见红 细胞均出现凝集(见表1)。
[0015] 表1分离毒株对不同种红细胞血凝(HA)图谱
在V型血凝板上，5排每孔滴加 PBS液(PH7.0 )0.025mL，每孔分别滴加待检病毒0.025mL， 混匀后弃去〇.〇25mL，第1排每孔滴加抗NDV标准阳性血清0.025mL，第2排每孔滴加抗AIV H9 亚型标准阳性血清0. 〇25mL，第3排每孔滴加抗AIV H5亚型标准阳性血清0.025mL，第4排每 孔滴加抗EDS标准阳性血清0.025mL，第5排滴加盐水0.025mL为对照，充分混匀后室温下孵 育20min。之后滴加1%(v/v)红细胞悬液0.025mL，每种红细胞1列孔，充分混匀后室温下作用 35min，观察可见，第1、5排红细胞无凝集，第2、3、4排红细胞凝集(见表2)。
[0016] 表2分离毒株对不同红细胞血凝性抑制试验
4鸡胚平均致死时间(MDT)测定 将新鲜的感染尿囊液用灭菌生理盐水连续10倍递增稀释成1〇_7-1〇_9。每个稀释度经 尿囊腔上午8点接种5枚10日龄SPF鸡胚，O.lmL/胚，置于37°C培养。同日16点，每个稀释度另 接种5枚鸡胚，0