. lmL/胚，置于37 °C培养。
[0017] 每天照蛋2次，连续观察7d，记录各鸡胚的死亡时间，计算出MDT值大于130小时。 [0018] 5脑内致病指数(ICPI)测定 取HA大于24的新鲜感染尿囊液没用无菌盐水10倍稀释，脑内接种1日龄SPF雏鸡10只， 0.05mL/只。每24小时观察一次，连续观察8d。每天观察时正常鸡记0分，病鸡记1分，死亡鸡 记2分。计算结果ICPI为0.3875 · 6至此判定分离毒株为NDV弱毒株。将病毒盲传19代后，基本生物活性无变化，命名为 XX09. 表3部分代次病毒红细胞凝集价(HA)的测定
表4部分代次病毒含量测定(单位:EID50/0. lmL) 7油乳刑火沽投百的妍制及应用
7.1抗原制备。以F19代毒按1:1000稀释，0.2mL/胚接种于9-10日龄鸡胚尿囊腔，37°C 孵育，每天照蛋2次，弃24h内死胚，24h后死胚及时取出放置于4°C保存，孵育96h后取出所有 鸡胚4°C放置36h，收获尿囊液。HA价1:128以上的毒液，计量加入0.1%的甲醛溶液，37 °C灭 活24h，取样作灭活检验。
[0019] 7.2油相制备。白油和Span-80按94:6，混合后，加总重量2%的硬脂酸铝，搅拌至透 明，121°C高压灭菌30min，即为油相。
[0020] 7 · 3水相制备。抗原液和灭菌后的Tween-80按96:4混合，充分振摇，使Tween-80完 全溶解，即为水相。
[0021 ] 7.4乳化。油相和水相按照2:1混合乳化。即油相2份注入胶体磨中，打开开关搅动 油相，同时缓慢加入水相1份，搅拌转速由慢到快充分乳化，即成油乳剂灭活疫苗。
[0022] 7.5疫苗物理性状检验 7.5.1外观检查。肉眼观察为乳白色乳剂。
[0023] 7.5.2稳定性检验。分别取试制疫苗样品10mL装于离心管中，以3000r/min离心 15min，疫苗不分层。37°C保存1个月不破乳。
[0024] 7.5.3粘度检验。出口径1.2mm的lmL吸管吸取疫苗样品lmL，让其垂直自然流出， 流出0.4mL所需的时间均在2-6s。
[0025] 7.5.4无菌检验。按中华人民共和国兽药典（生物制品卷）要求进行：取灭活苗样 品，接种硫乙醇酸盐流体培养基(τ.G)小管及酪胨琼脂(G.A)斜面各2支，0.2mL/支，1支置37 °C培养，1支置25 °C培养，观察3-5d。另取0.2mL接种一支葡萄糖蛋白胨肉汤(G. P)小管，25 °C 观察3-5d。均无细菌、霉菌生长。另外接种改良Frey氏液体及固体培养基观察30d，无支原体 生长。
[0026] 7.5.5疫苗安全检验。取灭活疫苗每批样品，每批疫苗颈部皮下注射14日龄SPF鸡 各10只，2.OmL/只。饲养两周，无发病与死亡，注射部位未见明显的病理变化，免疫鸡无异常 表现。
[0027] 7.5.6疫苗效力试验。将制备的灭活疫苗，接种非免疫鸡60只，分别在免疫前7d，免 疫后7d、14d、21d、28d采血，进行抗体效价测定。用分离的新城疫XX09株和强毒F48E9株，对 免疫后30d的鸡攻毒，每只鸡攻毒剂量105·*3个ELD5Q，每组30只，观察10d，另用非免疫鸡10只 攻毒作对照。
[0028] 7.5.7疫苗效力试验结果表明，接种疫苗21d后抗体效价开始上升，60d后平均抗 体效价达29·6。疫苗注射三周后，人工感染实验组不引起发病，而对照组攻毒3d后陆续发病， 病鸡精神沉郁，腹泻，排水样粪便，强毒组发病率达100%，xx〇9组发病率约47%。
[0029] 8重复7.1-7.5的方法，共制油乳剂灭活疫苗7批。
[0030] 9用LaSota株为抗原，以7.1-7.5的方法，制油乳剂灭活疫苗。与XX09株疫苗做保护 对比试验。可见两种疫苗保护率均达100%。 「nmi1 1 η丰「欠 ?Κ?选播害症害今兽、Mil由会圭里rpTr^/r? w、
11表6各批次灭活疫苗免疫60d后血清的血凝抑制价
上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领 域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这 里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处 于本发明创造的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种鸡新城疫弱毒株，藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生 物保藏编号为CGMCC No. 11290。2. 如权利要求1所述的一种鸡新城疫弱毒株在制备鸡新城疫弱毒活疫苗中的应用。3. 如权利要求1所述一种鸡新城疫弱毒株，由其制备鸡新城疫油乳剂灭活疫苗的制备， 其特征在于:步骤包括： (1) 以权利要求1所述的弱毒株为种毒，稀释后接种鸡胚尿囊腔，孵育96h后收获尿囊 液，计量加入甲醛溶液灭活，即得抗原液； (2) 以白油和Span-80按94:6的比例混合后，加2%的硬脂酸铝，搅拌至透明，高压灭菌即 得油相； (3 )抗原液和灭菌后的Tween-80按96:4比例混合，充分振摇，使Tween-80完全溶解，即 为水相； (4)油相和水相按照2份：1份混合乳化，即油相2份注入胶体磨中，打开开关搅动油相， 同时缓慢加入水相1份，搅拌转速由慢到快充分乳化，即完成制备。
【专利摘要】一种鸡新城疫弱毒株及其在制备鸡新城疫油乳剂灭活疫苗的应用，本发明的目的是提供一种低致病力的鸡新城疫病毒，该病毒具有免疫原性好，安全的特性。本发明的技术方案是，一种鸡新城疫弱毒株，藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏编号为CGMCC？No.11290。本发明分离得到的毒株是一株免疫原性好、生产性能优良、适宜大规模生产的种毒。由该毒株制备的活疫苗产品质量合格，具备产业化生产的条件。CGMCC No. 1129020151019
【IPC分类】C12N7/00, A61P31/14, A61K39/17, C12R1/93
【公开号】CN105647876
【申请号】
【发明人】赵坤, 徐小博, 徐萍, 刘明成, 王丽荣, 王元元, 李任峰
【申请人】河南科技学院
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月29日