一种以竹笋壳降解产物为诱导剂培养霉菌生产纤维素酶的方法
【专利说明】一种以竹笋壳降解产物为诱导剂培养霉菌生产纤维素酶的方法
技术领域
[0001]本发明属于发酵工程领域，具体地涉及纤维素酶的生产方法。以黑曲霉为菌种，葡萄糖为碳源，添加纤维素酶诱导剂，液态发酵生产纤维素酶。
【背景技术】
[0002]纤维素酶是一类能将纤维素水解成葡萄糖的生物酶，纤维素酶属于诱导酶，产纤维素酶的微生物必须在环境中存在纤维素类底物的条件下才会合成纤维素酶。目前工业化生产纤维素酶的方法是通过在纤维素类介质上培养能合成纤维素酶的微生物，主要是黑曲霉、木霉和青霉等霉菌，这些霉菌在生长过程中由细胞内合成纤维素酶并分泌至细胞外。天然纤维素类介质不溶于水，工业化生产纤维素酶往往采用固态发酵工艺，但是固态发酵很多发酵参数不易自动化控制。
[0003]很多科学研究结果表明，天然纤维素是大分子物质，不能直接进入微生物细胞内部诱导细胞组件合成纤维素酶，真正发挥“诱导”作用的物质是纤维素或半纤维素在细胞外经水解产生的小分子物质，如二糖和寡糖等，这些小分子物质进入细胞后经过进一步的转化形成了纤维素酶的合成因子。
[0004]竹笋壳中含有大量的纤维素、半纤维素和木质素，以竹笋壳作为主要成分制作栽培料栽培平菇，平菇菌丝产生丰富的胞外水解酶分解纤维素和半纤维素，平菇成熟采摘后剩余的栽培料称为“菇渣”，菇渣中仍然含有很多纤维素酶的合成因子，这些合成因子经抽提分离后可以用来作为纤维素酶的诱导剂。
[0005]葡萄糖是发酵工程中的速效碳源，产纤维素酶的微生物可以利用葡萄糖作基质快速生长繁殖，但是葡萄糖也是一种纤维素酶合成的抑制剂，葡萄糖分子抑制了微生物细胞内纤维素酶合成因子的生成，所以当培养基中存在葡萄糖时，微生物的个体生长很快但不能合成纤维素酶。
【发明内容】
[0006]为了使产纤维素酶的微生物能在液态发酵系统中既快速生长繁殖又高效合成纤维素酶，本发明提供一种以竹笋壳降解产物为诱导剂培养霉菌生产纤维素酶的方法。
[0007]本发明通过改进葡萄糖发酵培养基的配方，在葡萄糖发酵培养基中添加纤维素酶合成因子作诱导剂，在发酵过程中微生物个体既可以快速生长繁殖又可以高效的合成纤维素酶，同时提升农副残余的综合利用价值。
[0008]具体的技术解决方案如下:
一种以竹笋壳降解产物为诱导剂培养霉菌生产纤维素酶的操作步骤如下:
(I)用竹笋壳制作诱导剂
(1.1)按重量比4:1将竹笋壳干粉和麸皮混和，加水拌匀、灭菌，制成发酵底料；
(1.2)在发酵底料中接入平菇菌种，好氧固态发酵，当菌丝长密长实，发酵完成;发酵底料中的竹笋壳干粉被部分降解，成为平菇发酵料；
(1.3)将平菇发酵料烘干至恒重，粉碎，得到纤维素酶诱导粉剂；
(1.4)将纤维素酶诱导粉剂和自来水混和，加热，沸水浸提，静置冷却，取上层清液蒸发浓缩制成纤维素酶诱导水剂；
(2)配制霉菌液体发酵培养基，培养基配方如下:
葡萄糖2.0 g、氯化钠(NaCl)0.05 g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1 g、七水硫酸镁(MgSO4.7_0.05 g、硫酸铵((NH4)2S04) 0.2 g、纤维素酶诱导水剂10 mL和水90 mL；
(3)霉菌好氧发酵
在霉菌液体发酵培养基中接入黑曲霉孢子悬液，好氧恒温发酵，得到发酵液；
(4)发酵液后处理
将发酵液经过滤或离心处理，分离出其中的菌丝球，所得清液中纤维素酶活不低于4U/mL，将清液浓缩制成纤维素酶浓缩液或冻干制成纤维素酶粉剂。
[0009]进一步限定的技术方案如下:
步骤(1.1)中竹笋壳干粉过40目筛，按重量比4:1将竹笋壳干粉和麸皮混和，再加入干物质重量2倍的自来水拌匀。
[0010]步骤(1.2)中接种量为发酵底料重量的5%，温度28±2°C条件下，培养15d。
[0011 ]步骤(1.3)中将平菇发酵料在80°C温度下烘干。
[0012]步骤(1.4)中纤维素酶诱导粉剂和自来水混和的比例是重量比1:10，沸水浸提20min，蒸发浓缩制成纤维素酶诱导水剂的体积是原液体积的1/10。
[0013]步骤(3)中霉菌好氧发酵的工艺条件:摇瓶发酵时，100mL霉菌液体发酵培养基中接入浓度(1.10?1.20) X 16个/mL的I mL黑曲霉孢子悬液，恒温摇床培养;转速180 r/min、温度32 °C、发酵时间72 h。
[0014]步骤(3)中霉菌好氧发酵的工艺条件:5L发酵罐发酵时，2 L霉菌液体发酵培养基中接入浓度(1.10?1.20) X 1fMVmL的20 mL黑曲霉孢子悬液，搅拌转速800 r/min、通气量0.5 L/min、温度32°C、发酵时间72 h。
[0015]步骤(4)中处理清液的具体制剂方法是:-40°C真空冷冻干燥48h，制成纤维素酶粉剂;或室温下真空杯过滤浓缩，滤膜透过分子量小于500 Da，制成纤维素酶浓缩液。
[0016]本发明的有益技术效果体现在以下方面:
1.在培养基中不含纤维素类物质的情况下，实现了纤维素酶的液态发酵生产。
[0017]2.本发明提高了竹笋的综合利用价值，竹笋可以制作成多种类型的食品，竹笋加工的残余一一竹笋壳，可以用来栽培平菇，平菇采摘后的菇渣，可以继续用于生产纤维素酶，这种对竹笋的综合利用为农产品深加工提供了一种新模式。
【具体实施方式】
[0018]下面通过实施例，对本发明作进一步详细说明。
[0019]本发明所用黑曲霉菌种购自中国典型培养物保藏中心，拉丁学名分别为Aspergillus nigerD
[0020]实施例1
以竹笋壳降解产物为诱导剂培养霉菌生产纤维素酶的具体操作步骤如下: 1.制作纤维素酶诱导粉剂
1.1将竹笋壳冲洗干净，600C烘箱中烘干，粉碎，过40目筛得竹笋壳干粉，取1g竹笋壳干粉和2.5 g麸皮混和，再加入25 mL自来水，拌匀，装入250 mL锥形瓶中121°C高压蒸汽灭菌60 min，冷却，得到发酵底料；
1.2.平菇发酵降解竹笋壳
在发酵底料中接入2g平菇菌种，温度30°C、湿度70%条件下，培养15 d，当菌丝长密长实，发酵完成;发酵底料中的竹笋壳被部分降解，成为平菇发酵料；
1.3.平菇发酵料后处理
将平菇发酵料打散，80 °C烘干，粉碎，制得纤维素酶诱导粉剂；
2.制作竹笋壳降解产物的水浸提液
称取1g纤维素酶诱导粉剂于大烧杯中，加入1000 mL的自来水，电炉加热至沸腾，保持微沸30 min，期间每隔5 min搅拌一次，然后静置、冷却，取上清液300 mL，分装入3只250 mL的锥形瓶，每瓶100 mL上清液。
[0021 ] 3.配制霉菌液体发酵培养基
在100 mL的上清液中加入如下物质:2.0g葡萄糖，0.05g氯化钠(NaCl)，0.1g磷酸二氢钾(KH2P04)