，0.05 g七水硫酸镁(MgS04.7H20)，0.2 g硫酸铵((NH4)2SO4)，溶解混匀后1210C高压蒸汽灭菌20 min，得到霉菌液体发酵培养基。
[0022]3.霉菌好氧发酵
在100 mL霉菌液体发酵培养基中接入浓度1.10X 16个/mL的I mL黑曲霉孢子接种剂，锥形瓶置于恒温摇床振荡培养48 h，摇床温度32°C，转速180 r/min，得到发酵液。
[0023]黑曲霉孢子接种剂的制作:取I支培养有黑曲霉孢子的PDA培养基斜面试管，往斜面试管中加入15 mL的无菌生理盐水，刮取斜面上的黑曲霉孢子振荡混匀成孢子悬液，再取I mL孢子悬液加入30 mL的无菌生理盐水中，混匀制成黑曲霉孢子接种剂，显微镜计数测定接种剂中的孢子浓度为I.1X 16个/mL;
4.发酵液后处理
将发酵液以10000 r/min的转速离心3 min，取上层清液。经检测，每毫升清液中的纤维素酶活达到4.80个单位。将上层清液在室温下真空杯过滤浓缩，滤膜透过分子量小于500Da，制成纤维素酶浓缩液。
[0024]注:羧甲基纤维素酶活性检测方法参考“轻工行业标准:羧甲基纤维素钠法测定纤维素酶酶活QB 2583-2003”，I单位纤维酶活性定义为:I mL发酵液在I h催化生成I mg还原糖。
[0025]实施例2
以竹笋壳降解产物为诱导剂培养霉菌生产纤维素酶的具体操作步骤如下:
1.制作纤维素酶诱导粉剂具体操作方法同实施例1。
[0026]2.制作竹笋壳降解产物的水浸提液
称取50 g纤维素酶诱导粉剂于大烧杯中，加入5 L自来水，将大烧杯置于高压蒸汽灭菌锅中，105°C保温30 min，然后静置、冷却，取上清液2 L置于5 L的不锈钢发酵罐中。
[0027]3.配制霉菌液体发酵培养基在2 L上清液中加入如下物质:20.0 g葡萄糖，1.0 g氯化钠(NaCl)，2.0 g磷酸二氢#(KH2PO4) ,1.0 g 七水硫酸镁(MgS(V7H20)，4.0 g 硫酸铵((NH4)2SO4)，溶解混匀后 121°C高压蒸汽灭菌20 min，得到霉菌液体发酵培养基。
[0028]4.霉菌好氧发酵
在2 L霉菌液体发酵培养基中接入浓度1.20 X 16个/mL的20 mL黑曲霉菌孢子接种剂，32°C搅拌培养36 h，发酵罐搅拌转速800 r/min，通气量0.5 L/min，得到发酵液。
[0029]黑曲霉孢子接种剂的制作:取I支培养有黑曲霉孢子的PDA培养基斜面试管，往斜面试管中加入15 mL的无菌生理盐水，刮取斜面上的黑曲霉孢子振荡混匀成孢子悬液，再取I mL孢子悬液加入30 mL的无菌生理盐水中，混匀制成黑曲霉孢子接种剂，显微镜计数测定接种剂中的孢子浓度为1.20 X 16个/mL;
4.发酵液后处理
将发酵液以10000 r/min的转速离心3 min，取上层清液。经检测，每毫升清液中的纤维素酶活达到4.52个单位。将上层清液在-40°C真空冷冻干燥48 h，制成纤维素酶粉剂。
[0030]注:纤维素酶活测定方法及酶活单位定义同实施例1。
【主权项】
1.一种以竹笋壳降解产物为诱导剂培养霉菌生产纤维素酶的方法，其特征在于操作步骤如下: (I)用竹笋壳制作诱导剂 (1.1)按重量比4:1将竹笋壳干粉和麸皮混和，加水拌匀、灭菌，制成发酵底料； (1.2)在发酵底料中接入平菇菌种，好氧固态发酵，当菌丝长密长实，发酵完成;发酵底料中的竹笋壳干粉被部分降解，成为平菇发酵料； (1.3)将平菇发酵料烘干至恒重，粉碎，得到纤维素酶诱导粉剂； (1.4)将纤维素酶诱导粉剂和自来水混和，加热，沸水浸提，静置冷却，取上层清液蒸发浓缩制成纤维素酶诱导水剂； (2 )配制霉菌液体发酵培养基，培养基配方如下: 葡萄糖2.0 g、氯化钠0.05 g、磷酸二氢钾0.1 g、七水硫酸镁0.05 g、硫酸铵0.2 g、纤维素酶诱导水剂1 mL和水90 mL ； (3)霉菌好氧发酵 在霉菌液体发酵培养基中接入黑曲霉孢子悬液，好氧恒温发酵，得到发酵液； (4)发酵液后处理 将发酵液经过滤或离心处理，分离出其中的菌丝球，所得清液中纤维素酶活不低于4U/mL，将清液浓缩制成纤维素酶浓缩液或冻干制成纤维素酶粉剂。2.根据权利要求1所述的一种以竹笋壳降解产物为诱导剂培养霉菌生产纤维素酶的方法，其特征在于:步骤(1.1)中竹笋壳干粉过40目筛，按重量比4:1将竹笋壳干粉和麸皮混和，再加入干物质重量2倍的自来水拌勾。3.根据权利要求1所述的一种以竹笋壳降解产物为诱导剂培养霉菌生产纤维素酶的方法，其特征在于:步骤(1.2)中接种量为发酵底料重量的5%，温度28 ± 2°C条件下，培养15 d。4.根据权利要求1所述的一种以竹笋壳降解产物为诱导剂培养霉菌生产纤维素酶的方法，其特征在于:步骤(1.3)中将平菇发酵料在80°C温度下烘干。5.根据权利要求1所述的一种以竹笋壳降解产物为诱导剂培养霉菌生产纤维素酶的方法，其特征在于: 步骤(1.4)中纤维素酶诱导粉剂和自来水混和的比例是重量比1:10，沸水浸提20 min，蒸发浓缩制成纤维素酶诱导水剂的体积是原液体积的1/10。6.根据权利要求1所述的一种以竹笋壳降解产物为诱导剂培养霉菌生产纤维素酶的方法，其特征在于: 步骤(3)中霉菌好氧发酵的工艺条件:摇瓶发酵时，100 mL霉菌液体发酵培养基中接入浓度(1.10?1.20) X 1fMVmL的I mL黑曲霉孢子悬液，恒温摇床培养;转速180 r/min、温度32°C、发酵时间72 ho7.根据权利要求1所述的一种以竹笋壳降解产物为诱导剂培养霉菌生产纤维素酶的方法，其特征在于:步骤(3)中霉菌好氧发酵的工艺条件:5 L发酵罐发酵时，2 L霉菌液体发酵培养基中接入浓度(1.10?1.20) X 1MVmL的20 mL黑曲霉孢子悬液，搅拌转速800 r/min、通气量0.5 L/min、温度32°C、发酵时间72 h。8.根据权利要求1所述的一种以竹笋壳降解产物为诱导剂培养霉菌生产纤维素酶的方法，其特征在于: 步骤(4)中处理清液的具体制剂方法是:-40°C真空冷冻干燥48 h，制成纤维素酶粉剂；或室温下真空杯过滤浓缩，滤膜透过分子量小于500 Da，制成纤维素酶浓缩液。
【专利摘要】本发明公开了一种以竹笋壳降解产物为诱导剂培养霉菌生产纤维素酶的方法。具体操作步骤如下：（1）制作竹笋壳降解产物的水浸提液；（2）以葡萄糖为碳源、竹笋壳降解产物的水浸提液为溶剂配制液体发酵培养基；（3）在培养基中接入能产纤维素酶的霉菌菌种，好氧发酵；（4）将发酵液中的霉菌菌丝分离，所得清液中即含大量纤维素酶。本发明在培养基中不含纤维素类物质的情况下，实现了纤维素酶的液态发酵生产，同时提升了竹笋的综合利用价值。
【IPC分类】C12R1/685, C12N9/42
【公开号】CN105647890
【申请号】
【发明人】章建国, 魏兆军, 胡飞
【申请人】合肥工业大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年4月6日