含乳饮料中γ-氨基丁酸和16种蛋白水解氨基酸同时检测的专用高精度高效液相色谱方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于氨基酸检测技术领域，具体为含乳饮料中γ-氨基丁酸和16种蛋白水 解氨基酸同时检测的高效液相色谱方法。
【背景技术】
[0002] γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系 统的抑制性传递物质，是脑组织中最重要的神经递质之一。它能够结合抗焦虑的脑受体并 使之激活，然后与另外一些物质协同作用，阻止与焦虑相关的信息抵达脑中枢，能够降低神 经元活性，舒缓人们的不安、压力、疲倦、忧虑等状况。
[0003] 2009年卫生部批准GABA为新资源食品，以L-谷氨酸为原料经希氏乳杆菌发酵制 成，可应用于饮料及糖果、膨化食品等中。乳品作为人们普遍食用的消费品之一，GABA与牛 奶的结合，能够使人们很好地在补充日常营养所需的同时缓解压力、减少不安。
[0004] 针对γ -氨基丁酸，现行轻工行业标准QB/T 4587-2013《γ -氨基丁酸》的规范性 附录中提供了 γ-氨基丁酸含量检测方法;张晖等(2003)采用0ΡΑ柱前自动衍生测定了米胚 芽中的γ-氨基丁酸;涂云飞等(2012)采用柱前衍生高效液相色谱法测定茶叶中的γ-氨基 丁酸;胡雪莲等(2015)采用高效液相色谱法测定了黑莓果汁及黑莓啤酒中的γ-氨基丁酸。 针对氨基酸检测，现行国家标准GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》，用于测定食 品中16种氨基酸，但是采用全自动氨基酸分析仪。
[0005] 这些方法或是对米胚芽、茶叶、黑莓果汁和啤酒中的γ-氨基丁酸进行检测，或是 对食品中16种氨基酸的检测，对含乳饮料中γ -氨基丁酸和16种蛋白水解氨基酸同时检测 的快速准确的分析检测方法还鲜见报道。因此，开展含乳饮料中γ-氨基丁酸和16种蛋白水 解氨基酸同时检测方法的研究工作，对提高产品品质、加强监督具有重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种含乳饮料中γ-氨基丁酸和16种蛋白水解氨 基酸同时检测的专用高精度高效液相色谱方法，具有极高的灵敏度和优越的稳定性。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
[0008] 含乳饮料中γ-氨基丁酸和16种蛋白水解氨基酸同时检测的专用高精度高效液相 色谱方法，设定样品水解、衍生处理、上柱检测三个操作步骤，然后针对含乳饮料的特性设 定上述三操作步骤所使用的处理试剂及试剂用量及处理参数，使得上述三操作步骤的工艺 参数相互严密配合，实现对含乳饮料中γ-氨基丁酸和16种蛋白水解氨基酸的一步式高精 度检测。
[0009] 作为本发明的一种优选技术方案，该检测方法包括如下步骤： Α、制备含乳饮料水解样品：取含乳饮料置于水解管中，加入盐酸和苯酚后随即冷冻处 理，然后充入惰性气体并拧紧水解管螺盖，再将水解管放入恒温干燥箱进行充分水解，然后 将水解液取出过滤，取滤液干燥蒸干，再次用盐酸溶解并精滤到高效液相色谱的进样瓶中； B、 水解样品的自动柱前衍生处理:在室温条件下，吸收步骤A所得样品并与和硼酸缓冲 液、邻苯二甲醛混匀，再吸取9-芴基甲基氯甲酸酯混匀，准备上样； C、 高效液相色谱检测γ -氨基丁酸和16种氨基酸的含量:高效液相色谱的分离条件为， 色谱柱:通用的C18液相色谱柱;柱温:40°C;流动相Α:纯水中加入结晶乙酸钠混匀，调pH调 后加入四氢呋喃;流动相B:纯水中加入结晶乙酸钠混匀，调pH后加入乙腈和甲醇混匀;梯度 洗脱条件设定如下： 检测条仵设定如卜：检测器米用二极管
阵列或紫外检测器；〇_25min，设定检测波长 338nm; 25-32min，设定检测波长262nm; 32-35 · 5min，设定检测波长338nm。
[0010]作为本发明的一种优选技术方案，该检测方法包括如下步骤，下述步骤中涉及的 重量份均以克为单位计算，涉及的体积份均以毫升为单位计算： A、制备含乳饮料水解样品：取含乳饮料1重量份置于水解管中，加入浓盐酸1-3体积份 或加入6mol/L盐酸10-15体积份，再加入新蒸馏的苯酚3-4滴，将水解管放入冷冻剂中，冷冻 3min-5imn，充入高纯氮气并在充氮气状态下拧紧螺盖，将水解管放入109-111°C的恒温干 燥箱中，水解20-30小时后取出冷却，打开水解管，将水解液全部过滤转移到容量瓶中，取滤 液1-2体积份用真空干燥器在40°C_50°C干燥，蒸干，用0.5-2体积份0. lmol/L的盐酸溶解， 然后采用0.2μπι-0.8μπι的滤膜过滤到高效液相色谱进样瓶中； Β、水解样品的自动柱前衍生处理:在室温条件下，吸收步骤Α所得样品0.5-2体积份，吸 取硼酸缓冲液3-7体积份，吸取邻苯二甲醛0.5-2体积份，混匀，再吸取9-芴基甲基氯甲酸酯 0.5-2体积份，混匀，准备上样； C、高效液相色谱检测γ -氨基丁酸和16种氨基酸的含量:高效液相色谱的分离条件为， 色谱柱:通用的C18液相色谱柱;柱温:40°C ;流动相A: 1000体积份纯水中加入4-8重量份结 晶乙酸钠，混匀，pH调为7.15-7.25，再加入3-5体积份四氢呋喃;流动相B: 400体积份纯水中 加入6-12重量份结晶乙酸钠，混匀，pH调为7.15-7.25，再加入600-1000体积份乙腈和600- 1 八八八 /士 //、m 3P古、、/曰 Λ-r 士?? Firt Λ?
检测条件设定如下：检测器采用二极管阵列或紫外检测器;〇_25min，设定检测波长 338nm; 25-32min，设定检测波长262nm; 32-35 · 5min，设定检测波长338nm。
[0011] 作为本发明的一种优选技术方案，该检测方法包括如下步骤，下述步骤中涉及的 重量份均以克为单位计算，涉及的体积份均以毫升为单位计算： A、制备含乳饮料水解样品：取含乳饮料1重量份置于水解管中，加入浓盐酸2体积份或 加入6mo 1/L盐酸12体积份，再加入新蒸馏的苯酚3滴，将水解管放入冷冻剂中，冷冻4imn，充 入高纯氮气并在充氮气状态下拧紧螺盖，将水解管放入ll〇°C的恒温干燥箱中，水解24小时 后取出冷却，打开水解管，将水解液全部过滤转移到25mL容量瓶中，取滤液1.5体积份用真 空干燥器在45°C干燥，蒸干，用1体积份0. lmol/L的盐酸溶解，然后采用0.45μπι的滤膜过滤 到高效液相色谱进样瓶中； Β、水解样品的自动柱前衍生处理:在室温条件下，吸收步骤Α所得样品1体积份，吸取硼 酸缓冲液5体积份，吸取邻苯二甲醛1体积份，混匀，再吸取9-芴基甲基氯甲酸酯1体积份，混 匀，准备上样； C、高效液相色谱检测γ -氨基丁酸和16种氨基酸的含量:高效液相色谱的分离条件为， 色谱柱:通用的C18液相色谱柱;柱温:40°C ;流动相A: 1000体积份纯水中加入6重量份结晶 乙酸钠，混匀，pH调为7.15-7.25，再加入4体积份四氢呋喃;流动相B: 400体积份纯水中加入 9重量份结晶乙酸钠，混匀，pH调为7.15-7.25，再加入800体积份乙腈和800体积份甲醇，混 勺.详磨袢腊客牴沿宙加下.
恆测求1十议疋50J Γ :恆测益术州>饭官件刈现系外恆测益；u-zomin，议疋恆测奴1X 338nm; 25-32min，设定检测波长262nm; 32-35 · 5min，设定检测波长338nm。
[0012] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤C中所述的C18液相色谱柱选用X Bridge C18色谱柱、Hypersil ODS C18色谱柱。
[0013] 本发明检测得到的γ -氨基丁酸和16种标准氨基酸衍生物色谱图，出峰顺序依次 为：（l)Asp，天门冬氨酸；（2)G