包含颗粒状脱细胞组织的混合凝胶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及再生医疗技术领域，具体而言，涉及包含:将使来自动物的生物组织进 行脱细胞所得的组织(脱细胞生物组织)粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白原和凝 血酶的混合凝胶及其利用方法。
【背景技术】
[0002] 将来自他人的生物组织的移植片进行移植时，接受移植者侧组织对移植片的排斥 反应成为问题。作为这种问题的解决方法，期待着开发人工组织。作为原材料，尝试了各种 高分子，但由于这些原材料与生物组织的相容性低，因此有时会发生移植片与生物组织的 接合部位的脱落或发生感染。
[0003] 因此，为了提高与生物组织的相容性，开发了如下技术:使用从生物组织中除去细 胞而残留的支持组织即脱细胞生物组织作为移植片的技术;使用将这样的脱细胞生物组织 粉碎而获得的组织(颗粒状脱细胞组织)的技术。
[0004] 其中，CryoLif e公司开发了可最初商业利用的进行了脱细胞的来自人的心瓣膜， AutoTissue公司为了治疗人的心脏疾病开发了进行了脱细胞的来自猪的心瓣膜。
[0005] 关于脱细胞组织、颗粒状脱细胞组织有以下的报道。非专利文献I (Sasaki S.等 人，Mol. Vis.，2009，15，2022-2028)、非专利文献2 (Hashimoto Y等人， Biomaterials, 2010，31，3941-3948)报道了 ：将通过高静水压处理进行了脱细胞的猪角 膜移植到兔眼中时发挥功能。专利文献1 (日本特开2013-42677号公报)公开了一种适合角 膜的脱细胞处理的处理液。非专利文献3 (Funamoto S·等人，Biomaterials, 2010，31， 3590-3595)报道了：通过高静水压处理将来自猪的大动脉脱细胞，对所得的脱细胞组织的 力学特性或体内能力进行评价的结果，力学特性没有受到高静水压处理的不良影响，炎症 反应得到抑制，该组织可以耐受动脉血压，而且在管腔表面没有形成血栓，还报道了 ：在移 植该血管后4周发生细胞浸润到血管壁的现象。非专利文献4 (Negishi J.等人，J. Artif. Organs，2011，14，223-231)报道了 ：在胶原蛋白变性得到了抑制的条件下将来 自大鼠的颈动脉脱细胞，再将该脱细胞的颈动脉移植到大鼠体内时，动脉闭塞得到抑制。
[0006] 非专利文献5 (Singelyn J. M.等人，Biomaterials, 2009，30，5409-5416)报 道了：利用表面活性剂将猪的心肌脱细胞，之后经过冷冻干燥、粉碎和胃蛋白酶消化，所得 的心肌基质自身缔合，形成多孔性纤维状水凝胶；以及内皮细胞、平滑肌细胞渗入到该水凝 胶中，使小血管的形成增加。非专利文献6 (Seif-Naraghi S.等人，J. Vis. Exp.，2010， 46, e2109)是将该水凝胶应用于左室自由壁后研究宿主反应。非专利文献7 (Singelyn J. M.等人，J. Am. Coll. Cardiol.，2012，59，751-763)报道了：将该水凝胶应用于心肌 梗塞模型大鼠时，使内源性的心肌细胞增加，保持了心脏功能，而没有引起心律不齐。非专 利文献8 (Sonya B.等人，Sci. Transl. Med.，2013，5，173ra25)报道了：将该水凝胶 应用于猪的心肌梗塞模型时，心脏功能、心室容积、心脏壁的整体运动有所改善，另外，该水 凝胶与大鼠具有生物相容性。非专利文献9 (Wolf Μ. T.等人，Biomaterials, 2012，33， 7028-7038)公开了 ：将来自猪的真皮或来自猪的膀胱经过脱细胞处理、冷冻干燥和胃蛋白 酶处理而得到的细胞外基质水凝胶应用于大鼠腹壁缺损部位时，与来自真皮的凝胶相比， 来自膀胱的凝胶被更快地分解，肌肉形成量更多。
[0007] 但是，该水凝胶在临床上并没有充分应用于靶部位的方法，因此设想其从应用部 位剥落或者添加的基质流失而从目标部位消失。颗粒状脱细胞组织根据其种类期待着其通 过自凝胶化而留置在应用部位，但凝胶化无法瞬间完成，而且与靶部位的亲和性也不充分。 特别是在心脏这样的动态组织中，该水凝胶难以留置在应用部位，其结果，暗示无法获得充 分的效果。
[0008] 专利文献2 (日本特表2002-518319号公报)报道了 ：将对人皮肤的脱细胞组织基 质AlloDerm (LifeCell公司制造)进行低温破坏而获得的粒状无细胞组织基质应用于大鼠 或猪时，没有发现严重的急性炎症性应答的征兆。
[0009] 现有技术文献 专利文献 专利文献1:日本特开2013-42677号公报； 专利文献2:日本特表2002-518319号公报； 专利文献3:日本专利第4092397号公报； 专利文献4:日本再公表2008-111530号公报； 专利文献5:日本特开2009-50297号公报； 专利文献6:日本特开2010-227246号公报； 专利文献7:日本专利第4189484号公报； 非专利文献 非专利文献l:Sasaki S.等人，Mol. Vis.，2009，15，2022-2028; 非专利文献2:Hashimoto Υ·等人，Biomaterials, 2010，31，3941-3948; 非专利文献3:Funamoto S.等人，Biomaterials, 2010，31，3590-3595; 非专利文献4:Negishi J.等人，J. Artif. Organs, 2011，14，223-231; 非专利文献5:Singelyn J. Μ·等人，Biomaterials, 2009，30，5409-5416; 非专利文献6:Seif-Naraghi S.等人，J. Vis. Exp., 2010，46，e2109; 非专利文献7:Singelyn J. Μ·等人，J. Am. Coll. Cardiol·, 2012，59，751-763; 非专利文献8:Sonya B.等人，Sci. Transl. Med·，2013，5，173ra25; 非专利文献9:Wolf M. T·等人，Biomaterials，2012，33，7028-7038; 非专利文献l〇:〇tt H. C.等人，Nature Medicine, 2008，14，213-221; 非专利文献ll:Barakat 0·等人，J. Surg. Res·, 2012，173，ell-e25; 非专利文献 12:ParkK. M.等人，Transplant. Proc·，2012，44，1151-1154; 非专利文献 13:0tt H. C.等人，Nature Medicine, 2010，16，927-933; 非专利文献 14:Yang B.等人，Tissue Eng. Part C Methods, 2010，16，1201-1211； 非专利文献 15:DeQuach J. A.等人，Tissue Eng. Part A, 2011，17，2583-2592。
【发明内容】
[0010] 发明所要解决的课题 如上所述，显示出颗粒状脱细胞组织没有对移植片的排斥反应，且对疾病部位的再生、 治愈有效，但更理想的颗粒状脱细胞组织希望具备以下几点。即，一种支架，在该支架处参 与再生、治愈的来自患者的细胞或导入的细胞在靶部位聚集，或者靶部位的成熟细胞脱分 化，这些细胞的增殖、分化、再分化的进程快速地进行；或者由颗粒状脱细胞组织重构的组 织、器官迅速地适应于宿主并发挥功能;容易应用于靶部位并在该部位迅速地凝胶化，确实 地留置在该部位;此外，可早期诱导用于对聚集的细胞供应营养的微细血管，促进上述效果 进而更有效地促进组织再生。
[0011] 用于解决课题的手段 为了解决上述课题，本发明人进行了深入研究的结果，在将来自脱细胞生物组织的颗 粒和纤维蛋白胶(纤维蛋白糊)组合应用于细胞或疾病模型动物时，（1)在来自心脏的细胞 中，发现了分化成心肌细胞和获得搏动等功能；（2)在心肌梗塞模型中，确认到了抑制心脏 壁厚度变薄的效果或新生血管的效果；（3)在神经前体细胞中，发现了诱导树突的形成/神 经突延长作用；（4)在皮肤冻伤模型中，确认到了在抑制冻伤部位挛缩的同时促进组织再生 的效果，从而完成了本发明。即，本发明包含以下的发明。
[0012] ?混合凝胶，其包含:将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的组织(脱细胞生 物组织)粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白原和凝血酶； ?疾病治疗药、细胞移植辅剂、或细胞培养基材，其特征在于，包含该混合凝胶； ?混合凝胶的制作方法，该方法包括下述步骤:将来自动物的生物组织脱细胞以获得脱 细胞生物组织的步骤;粉碎该脱细胞生物组织以获得颗粒状脱细胞组织的步骤；以及混合 该颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白原和凝血酶的步骤； ?组织再生疗法，该疗法包括:将该颗粒状脱细胞组织和纤维蛋白胶应用于动物组织； ?组织再生疗法，该疗法包括:将该混合凝胶应用于动物组织； ?细胞移植方法，该方法包括:将该颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白胶和细胞应用于动物 组织； ?细胞移植方法，该方法包括:将该混合凝胶和细胞一起应用于动物组织； ?细胞培养方法，该方法包括:将该混合凝胶和细胞一起进行培养； ?试剂盒，其包含将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的组织(脱细胞生物组织） 粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织和纤维蛋白胶。
[0013] 更具体而言，本发明包含以下的发明。
[0014] [ 1 ]混合凝胶，其包含:将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的组织(脱细胞 生物组织)粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白原和凝血酶。
[0015] [2] [1]所述的混合凝胶，其中，动物为人以外的动物。
[0016] [3] [1]或[2]所述的混合凝胶，其中，待被脱细胞的生物组织为具有基质结构的 生物组织。
[0017] [4] [1]~[3]中任一项所述的混合凝胶，其中，待被脱细胞的生物组织为选自心 脏、肝脏、肾脏、肺、脑和脊髓的一种以上的生物组织。
[0018] [5] [1]~[4]中任一项所述的混合凝胶，其中，脱细胞生物组织为对生物组织进 行高静水压处理而获得的脱细胞生物组织。
[0019] [6] [ I ]~[5]中任一项所述的混合凝胶，其中，凝血酶为0.8U/mL以上的浓度。
[0020] [7]疾病治疗药，其包含[1]~[6]中任一项所述的混合凝胶。
[0021 ] [8][7]所述的治疗药，其中，疾病治疗药选自心肌梗塞治疗药、神经损伤疾病治 疗药和皮肤冻伤治疗药的治疗药。
[0022] [9]细胞移植辅剂，其包含[1]~[6]中任一项所述的混合凝胶。
[0023] [ 10][9]所述的细胞移植辅剂，其中，细胞为来自心脏的细胞、神经前体细胞、或 来自组织干细胞的细胞。
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