500μπι以下者用作颗粒状脱细胞组织。
[0152] 2.移植实验 对Wistar大鼠（雄、8-12周龄)肌肉注射0.1 mL戊巴比妥进行麻醉处理。剃去背部的毛， 用聚烯吡酮碘消毒。在消毒后的背部制作Icm的切口，由切口层在皮层和肌肉层之间制作插 入混合凝胶的口袋。向制作的口袋中移植包含纤维蛋白凝胶的混合凝胶，用5-0缝合线缝合 切口层。经过规定的期间后，对大鼠实施安乐死，观察创伤部，回收样品。回收的样品通过HE 染色进行了组织学评价。
[0153] 3.组构成和观察 将混合凝胶中的纤维蛋白原浓度设为40mg/mL，将混合凝胶中的凝血酶浓度设为0.8U/ mL和125U/mL，对于各浓度添加颗粒状脱细胞组织使凝胶达到5%的浓度。还设定未添加颗粒 状脱细胞组织的组作为比较对象，对各试验组进行了研究。
[0154] 4.结果 结果见图9。即使在未添加颗粒状脱细胞组织的纤维蛋白凝胶中，也肉眼确认到了新生 血管的浸润。另外，无论凝血酶浓度如何，几乎没有确认到细胞浸润。在移植第3天和第7天 没有确认到明显的差别。另一方面，就添加了颗粒状脱细胞组织的混合凝胶而言，在其周围 肉眼可见丰富的新生血管，确认到了凝胶内部的细胞浸润和新生血管。此外，其程度根据凝 血酶浓度而变化，在凝血酶浓度为0.8U/mL时，确认到了更多的细胞浸润和新生血管。
[0155] 实施例9 研究颗粒状脱细胞组织的混合凝胶在大鼠皮肤冻伤模型中的效果 1.颗粒状脱细胞组织的调制 由Wistar大鼠采取肝脏组织，用生理盐水清洗。清洗后，将各组织与生理盐水一起放入 聚乙稀袋中，将袋密封。使用Dr. Chef (神户制钢公司制造)在3,000~10,000atm下进行了 高静水压处理。高静水压处理后的组织用含有核酸酶的清洗液和含醇清洗液清洗。清洗结 束后，将各脱细胞组织用冷冻干燥机(Eyela)进行冷冻干燥。冷冻干燥后的脱细胞组织用磨 机、食物处理机、玛瑙粉碎机(AS ONE)等粉碎成粉末状。通过筛分脱细胞粉末进行处理，将 直径为500μπι以下者用作颗粒状脱细胞组织。
[0156] 2.移植实验 对Wistar大鼠（雄、8-12周龄)肌肉注射0.1 mL戊巴比妥进行麻醉处理。剃去背部的毛， 用聚烯吡酮碘消毒。在消毒后的背部制作直至真皮中层的缺失(直径为15mm)。为了制造冻 伤，将通过液氮冷却的金属体在创伤部按压60秒。向冻结的创伤处添加颗粒状脱细胞组织 (肝脏），再滴加80mg/mL的纤维蛋白原溶液，滴加250U/mL的凝血酶溶液。设定仅滴加 BoIheal的组、未处置组作为对照。之后，用橡皮霄包覆创伤部，再用纱布包覆大鼠整个躯 干。
[0157] 3.组构成和观察 混合凝胶中的纤维蛋白原浓度设为40mg/mL，混合凝胶中的凝血酶浓度设为125U/mL， 对于各浓度添加颗粒状脱细胞组织使凝胶达到10%的浓度。还设定未添加颗粒状脱细胞组 织的组作为比较对象，观察了经过规定期间后的损伤部位。
[0158] 4.结果 结果见图10。在未处置组中，在冻伤部位看到了皮肤组织治愈过程所特有的皮肤的挛 缩。相对于此，在未添加颗粒状脱细胞组织的组中没有看到皮肤的挛缩。但是，尚未达到填 补由冻伤引起的皮肤缺失，处于被脆弱组织覆盖的状态。在添加了颗粒状脱细胞组织的组 中，也没有看到皮肤的挛缩，此外，肉眼可见皮肤缺失部位的组织再生早期进行。由此认为： 脱细胞粉末是促进加速皮肤再生的细胞聚集和支架填补的材料。
[0159] 产业实用性 本发明是可以在再生医疗领域应用的技术。
【主权项】
1. 混合凝胶，其包含:将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的组织即脱细胞生物 组织粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白原和凝血酶。2. 权利要求1所述的混合凝胶，其中，动物为人以外的动物。3. 权利要求1或2所述的混合凝胶，其中，待被脱细胞的生物组织为具有基质结构的生 物组织。4. 权利要求1~3中任一项所述的混合凝胶，其中，待被脱细胞的生物组织为选自心脏、 肝脏、肾脏、肺、脑和脊髓的一种以上的生物组织。5. 权利要求1~4中任一项所述的混合凝胶，其中，脱细胞生物组织为对生物组织进行 高静水压处理而获得的脱细胞生物组织。6. 权利要求1~5中任一项所述的混合凝胶，其中，凝血酶为0.8U/mL以上的浓度。7. 疾病治疗药，其包含权利要求1~6中任一项所述的混合凝胶。8. 权利要求7所述的治疗药，其中，疾病治疗药为选自心肌梗塞治疗药、神经损伤疾病 治疗药和皮肤冻伤治疗药的治疗药。9. 细胞移植辅剂，其包含权利要求1~6中任一项所述的混合凝胶。10. 权利要求9所述的细胞移植辅剂，其中，细胞为来自心脏的细胞、神经前体细胞、或 来自组织干细胞的细胞。11. 细胞培养基材，其包含权利要求1~6中任一项所述的混合凝胶。12. 权利要求11所述的细胞培养基材，其中，细胞为来自心脏的细胞、神经前体细胞、或 来自组织干细胞的细胞。13. 混合凝胶的制作方法，该方法包括下述步骤:将来自动物的生物组织脱细胞以获得 脱细胞生物组织的步骤;粉碎所述脱细胞生物组织以获得颗粒状脱细胞组织的步骤；以及 混合所述颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白原和凝血酶的步骤。14. 权利要求13所述的制作方法，其中，动物为人以外的动物。15. 权利要求13或14所述的制作方法，其中，待被脱细胞的生物组织为具有基质结构的 生物组织。16. 权利要求13~15中任一项所述的制作方法，其中，待被脱细胞的生物组织为选自心 脏、肝脏、肾脏、肺、脑和脊髓的一种以上的生物组织。17. 权利要求13~16中任一项所述的制作方法，其中，获得脱细胞生物组织的步骤包 括:将来自动物的生物组织脱细胞的步骤;以及微波照射并清洗的步骤。18. 权利要求13~17中任一项所述的制作方法，其中，脱细胞为对生物组织进行高静水 压处理来进行的。19. 权利要求13~18中任一项所述的制作方法，其中，粉碎脱细胞生物组织的步骤包 括:切碎脱细胞生物组织的步骤;将切碎了的脱细胞生物组织冷冻干燥或冻结的步骤；以及 将冷冻干燥或冻结了的脱细胞生物组织粉碎的步骤。20. 权利要求19所述的制作方法，该方法还包括:将粉碎了的脱细胞生物组织根据颗粒 大小进行筛分的步骤。21. 权利要求13~20中任一项所述的制作方法，其中，凝血酶为0.8U/mL以上的浓度。22. 组织再生疗法，该疗法包括:将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的组织即脱 细胞生物组织粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织和纤维蛋白胶应用于动物组织。23. 权利要求22所述的组织再生疗法，其中，成为脱细胞生物组织来源的动物为人以外 的动物。24. 权利要求22或23所述的组织再生疗法，其中，待被脱细胞的生物组织为具有基质结 构的生物组织。25. 权利要求22~24中任一项所述的组织再生疗法，其中，待被脱细胞的生物组织为选 自心脏、肝脏、肾脏、肺、脑和脊髓的一种以上的生物组织。26. 权利要求22~25中任一项所述的组织再生疗法，其中，脱细胞生物组织为对生物组 织进行高静水压处理而获得的脱细胞生物组织。27. 权利要求22~26中任一项所述的组织再生疗法，其中，待应用的动物为人以外的动 物。28. 权利要求22~27中任一项所述的组织再生疗法，其中，待应用的组织为心脏、神经 或皮肤。29. 组织再生疗法，该疗法包括:将权利要求1~6所述的混合凝胶应用于动物组织。30. 权利要求29所述的组织再生疗法，其中，待应用的动物为人以外的动物。31. 权利要求29或30所述的组织再生疗法，其中，待应用的组织为心脏、神经或皮肤。32. 细胞移植方法，该方法包括:将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的组织即脱 细胞生物组织粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织、纤维蛋白胶和细胞应用于动物组织。33. 细胞移植方法，该方法包括:将权利要求1~6所述的混合凝胶和细胞一起应用于动 物组织。34. 权利要求32或33所述的细胞移植方法，其中，细胞为来自心脏的细胞、神经前体细 胞、或来自组织干细胞的细胞。35. 权利要求32~34中任一项所述的细胞移植方法，其中，待应用的动物为人以外的动 物。36. 权利要求32~35中任一项所述的细胞移植方法，其中，待应用的组织为心脏、神经 或皮肤。37. 细胞培养方法，该方法包括:将权利要求1~6所述的混合凝胶和细胞一起进行培 养。38. 权利要求37所述的细胞培养方法，其中，细胞为来自心脏的细胞、神经前体细胞、或 来自组织干细胞的细胞。39. 试剂盒，其包含:将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的组织即脱细胞生物组 织粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织和纤维蛋白胶。40. 权利要求39所述的试剂盒，其中，成为脱细胞生物组织来源的动物为人以外的动 物。41. 权利要求39或40所述的试剂盒，其中，待被脱细胞的生物组织为具有基质结构的生 物组织。 4 2.权利要求3 9~41中任一项所述的试剂盒，其中，待被脱细胞的生物组织为选自心 脏、肝脏、肾脏、肺、脑和脊髓的一种以上的生物组织。43.权利要求39~42中任一项所述的试剂盒，其中，脱细胞生物组织为对生物组织进行 高静水压处理而获得的脱细胞生物组织。44. 权利要求39~43中任一项所述的试剂盒，其中，试剂盒为疾病治疗用试剂盒。45. 权利要求44所述的试剂盒，其中，疾病治疗用试剂盒为选自心肌梗塞治疗用试剂 盒、神经损伤疾病治疗用试剂盒和皮肤冻伤治疗用试剂盒的试剂盒。46. 权利要求39~43中任一项所述的试剂盒，其中，试剂盒为细胞移植用试剂盒。47. 权利要求46所述的试剂盒，其中，细胞为来自心脏的细胞、神经前体细胞、或来自组 织干细胞的细胞。48. 权利要求39~43中任一项所述的试剂盒，其中，试剂盒为细胞培养用试剂盒。49. 权利要求48所述的试剂盒，其中，细胞为来自心脏的细胞、神经前体细胞、或来自组 织干细胞的细胞。
【专利摘要】本发明提供：一种混合凝胶，其中包含颗粒状脱细胞组织(将来自动物的生物组织进行脱细胞处理所得的脱细胞生物组织粉碎而获得)、纤维蛋白原和凝血酶；包含该混合凝胶的细胞培养基材；该混合凝胶的制作方法；以及包含颗粒状脱细胞组织和生物组织粘合剂的试剂盒。本发明的混合凝胶具有促进干细胞的分化和功能获取的效果、以及对各种疾病的治疗效果。
【IPC分类】A61K35/12, A61K35/34, A61L27/00, A61K35/42, A61K35/30, A61K38/48, A61K35/407, A61K38/43, A61K9/06, A61K35/28, A61P9/10
【公开号】CN105658250
【申请号】
【发明人】松田纯一, 宫柱澄香, 原野里美, 岸田晶夫, 木村刚, 根岸淳, 樋上哲哉, 舩本诚一, 日渡谦一郎, 田崎晃子
【申请人】一般财团法人化学及血清疗法研究所, 国立大学法人东京医科齿科大学, 北海道公立大学法人札幌医科大学, 株式会社艾迪科
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年5月2日