胞可以存在于混合凝胶内或表面上。可以以使细胞存在于混合凝胶内或表面 上的状态应用于动物组织，也可以将混合凝胶或细胞应用于动物组织后再应用另一者。在 后一种情形下，对应用混合凝胶和细胞的顺序没有特别限定。
[0112]对细胞移植中使用的细胞没有特别限定。可以示例来自心脏的细胞、神经前体细 胞或来自组织干细胞的细胞。对应用细胞移植方法的组织没有特别限定。可以示例心脏、神 经或皮肤。
[0113] 7.细胞培养方法 本发明包含细胞培养方法，该方法包括:将上述混合凝胶和细胞一同进行培养。在本发 明的细胞培养方法中，在使混合凝胶和细胞共存于培养基中的情形下，可以将细胞直接接 种在混合凝胶上进行培养，或者可以在混合凝胶和细胞之间设置细胞培养插件进行培养。 对待培养的细胞没有特别限定。可以示例来自心脏的细胞、神经前体细胞或来自组织干细 胞的细胞。
[0114] 8.试剂盒 本发明包含试剂盒，该试剂盒包含:通过将使来自动物的生物组织进行脱细胞所得的 组织(脱细胞生物组织)粉碎而获得的颗粒状脱细胞组织和纤维蛋白胶。该试剂盒，当将颗 粒状脱细胞组织和纤维蛋白胶应用于动物组织时，在应用部位形成混合凝胶。
[0115] 如上所述，关于本发明的试剂盒，对回收生物组织的动物种类没有特别限定。优选 为人以外的动物，优选哺乳类的家畜、鸟类的家畜。作为哺乳类的家畜可以举出：牛、马、骆 驼、美洲驼、驴、牦牛、绵羊、猪、山羊、鹿、羊驼、狗、貉、黄鼠狼、狐狸、猫、兔、仓鼠、豚鼠、大 鼠、小鼠、松鼠、综熊等。作为鸟类的家畜可以举出：长尾小婴鸟鹉、鹤鹉、鸡、鸭、火鸡、鹅、珍珠 鸡、野鸡、鸵鸟、鹌鹑等。其中，从获取的稳定性方面考虑，优选猪或兔。
[0116] 生物组织可以示例：具有细胞外基质结构且可进行脱细胞处理的组织。这样的组 织为选自肝脏、肾脏、输尿管、膀胱、尿道、舌、扁桃体、食道、胃、小肠、大肠、肛门、胰脏、心 脏、血管、脾脏、肺、脑、骨、脊髓、软骨、精囊、子宫、输卵管、卵巢、胎盘、角膜、骨骼肌、肌腱、 神经、皮肤等的组织。特别优选为选自心脏、肝脏、肾脏、肺、脑、脊髓、精囊、脾脏、膀胱、血管 和皮肤等的组织。作为生物组织特别优选为心脏、肝脏、肾脏、肺、脑和脊髓。
[0117] 如上所述，关于本发明的混合凝胶，对脱细胞处理的方法没有特别限定。优选为高 静水压处理。对脱细胞颗粒的粒径没有特别限定，可以为0.1~ΙΟΟΟμπι、优选为0.5~500μπι、 进一步优选为1~100μπι。
[0118] 在本发明中，上述的混合凝胶对于疾病模型（心肌梗塞模型、皮肤冻伤模型）、细胞 (来自心脏的细胞、神经前体细胞)发挥了优异的效果，因此本发明的试剂盒包括疾病治疗 用试剂盒。作为这样的疾病治疗用试剂盒可以示例：心肌梗塞治疗用试剂盒、神经损伤治疗 用试剂盒、皮肤冻伤治疗用试剂盒。另外，作为本发明的试剂盒可以示例:细胞移植用试剂 盒、细胞培养用试剂盒。对细胞的种类没有特别限定，可以示例:来自心脏的细胞、神经前体 细胞、或来自组织干细胞的细胞。 实施例
[0119] 下面，伴随实施例，来更详细地说明本申请发明，但不限于下述的实施例。
[0120] 实施例1 研究来自成体兔心脏的颗粒状脱细胞组织对来自胎兔心脏的细胞的培养效果 1.来自胎兔心脏细胞的调制 对于约6月龄的日本白色种雌兔(Oriental Yeast)，按0.5U/个体以12小时的间隔皮下 给予6次FSH(前叶性卵泡刺激素:Antolin R_ 10、共立制药），在最终给予FSH后约5小时以 50U/个体静脉内给予hCG (胎盘性性腺刺激素(绒膜促性腺激素）：Puberogen、Vovarti s )，使 其与雄兔交配，制作了妊娠兔。在交配后第16.5~18.5天向妊娠兔的静脉内给予约200mg的 戊巴比妥注射液(Somnopentyl、共立制药），实施安乐死。剖腹后从子宫中取出胎儿，悬浮在 生理盐水（大塚生食注、大塚制药）中。由胎儿采取心脏，分散在约1.25%的胰蛋白酶溶液 (Difco)中，调制了细胞。
[0121] 2.颗粒状脱细胞组织的调制 由约6~12月龄的日本白色种兔(Oriental Yeast)采取心脏，用生理盐水清洗。清洗后， 将该组织和生理盐水一起放入聚乙烯袋中，将袋密封。使用Dr. Chef (神户制钢公司制造） 在3,000~10,000atm下进行了高静水压处理。高静水压处理后的组织用含核酸水解酶的清 洗液和含醇清洗液清洗。清洗结束后，将各脱细胞组织用冷冻干燥机(EyeIa)进行冷冻干 燥。冷冻干燥后的脱细胞组织用磨机、食物处理机、玛瑙粉碎机(AS ONE)等进行粉碎。通过 筛分颗粒状脱细胞组织进行处理，制作了直径为500M1以下的颗粒状脱细胞组织。该颗粒状 脱细胞组织在使用前于4°C下保存，用盐水调整成2mg/mL后使用。
[0122] 3.培养 在用0.1 %明胶溶液(S i gma)包被的TERASAKI板(Sumi ron)的每孔中添加I OyL添加有约 IO5个来自胎兔心脏的细胞和来自成体兔心脏的颗粒状脱细胞组织的Bolheal A液(按照附 属文件来调制，所含的G-CSF(Diaclone)的最终浓度（Bolheal中）为100ng/mL、bFGF (PROGEN)为lOng/mL和硒蛋白P片段（自家调制）为7yg/mL)，然后以IOyL/孔添加Bolheal B 液(按照附属文件进行调制，用生理盐水稀释至1/10)使其凝固（纤维蛋白化）。凝固后，将培 养基(含 10% FBS (Funakoshi)的DMEM (Sigma))重叠，在CO2培养箱(5%、37°C)内培养。
[0123] 4.组构成和观察 对于成体兔心脏16 (以16yg/mL的最终浓度添加来自成体兔心脏的颗粒状脱细胞组 织）、成体兔心脏64 (以64yg/mL的最终浓度添加来自成体兔心脏的颗粒状脱细胞组织）和 未添加(没有添加颗粒状脱细胞组织(Oyg/mL))的3组，在培养后第6天就增殖[按标准进行 定性判断:死亡或未增殖:-、增殖1~2倍左右：土、增殖2~5倍左右:+、增殖5倍以上:++]、分化 [以从接种时的形状(球形)开始的形状变化为指标进行评价(细胞的变化是指分化的细胞 的成熟或成熟过程）、无:_、至少从球形开始观察到形状变化：±、观察到明显的形状变化 (棒状化、扁平化、细胞突起形成等）： +、观察到明显的分化(推测分化成心肌、成纤维细胞、 细胞突起的复杂化等特定细胞种类的水平）：++]和搏动[没有观察到心跳:_、至少1例可以 观察到心跳：土、3例以上可以观察到心跳:+、多数(6例~)可以观察到心跳:++]进行了评价。
[0124] 5.结果 结果见表1。在未添加颗粒状脱细胞组织的组中，虽然观察到了所培养的来自胎兔心脏 的细胞的增殖，但没太观察到分化;同样也几乎没有看到搏动的细胞。当添加了颗粒状脱细 胞组织时，确认到了增殖和分化，还确认到了细胞的搏动。而且，当以64yg/mL的浓度添加颗 粒状脱细胞组织时，分化和搏动均显著。根据以上的结果明确了 ：来自成体兔心脏的颗粒状 脱细胞组织有助于来自胎兔心脏的细胞分化成心肌细胞以及获得搏动等功能。
[0125] [表 1]
实施例2 研究各种颗粒状脱细胞组织对培养来自胎兔心脏的细胞的效果 1.来自胎兔心脏的细胞的调制 利用与实施例1相同的方法来获得。
[0126] 2.颗粒状脱细胞组织的调制 对于利用与实施例1相同的方法采取的胎兔心脏和由约6~12月龄的日本白色种兔 (Oriental Yeast)采取的心脏、肾脏、肺、肝脏和由猪采取的肝脏，将组织与生理盐水一起 装入聚乙烯袋中，将袋密封。使用Dr. Chef (神户制钢公司制造)在3,000~10,000atm下进 行了高静水压处理。高静水压处理后的组织用含核酸酶的清洗液和含醇清洗液清洗。清洗 结束后，将各脱细胞组织用冷冻干燥机(Eyela)进行冷冻干燥。将该冷冻干燥了的脱细胞组 织用磨机、食物处理机、玛瑙粉碎机(AS ONE)等粉碎。通过筛分颗粒状脱细胞组织进行处 理，制作了直径为500μπι以下的颗粒状脱细胞组织。颗粒状脱细胞组织在使用前于4°C下保 存，用生理盐水调整成2mg/mL后使用。
[0127] 3.培养 在用0.1 %明胶溶液(S i gma)包被的多盘4孔(Nunc)的每孔中添加I OyL分别添加有约4 X IO5个的来自胎兔心脏的细胞和上述的颗粒状脱细胞组织的Bolheal A液(按照附属文件来 调制，用生理盐水稀释至1/2)，然后以10μL7孔添加Bolheal B液(按照附属文件来调制，用 生理盐水稀释至1/10)，使其凝固（纤维蛋白化）。凝固后，将培养基(含10% FBS(Funakoshi) 的DMEM (Sigma))重叠，在C〇2培养箱(5%、37。。）内培养。
[0128] 4.组构成和观察 对于分别以500yg/mL的浓度添加有来自胎兔心脏、成体兔心脏、成体兔肾脏、成体兔 肺、成体兔肝脏、成体猪肝脏的颗粒状脱细胞组织的试验组、未添加(未添加颗粒状脱细胞 组织（Oyg/mL))和对照（未添加颗粒状脱细胞组织（Oyg/mL)/未添加Bolheal (包括含有 物））的试验组进行了研究。与实施例1同样，分别在培养第7天对增殖、分化和搏动实施了评 价。
[0129] 5.结果 结果见表2。在对照中没太确认到增殖，但确认到了分化成膨化的细胞的趋势。没有确 认到搏动的细胞。未添加组虽然确认到了增殖/分化，但没太确认到搏动的细胞。相对于此， 添加有颗粒状脱细胞组织的组确认到了增殖/分化、还确认到了搏动的细胞，而与动物种 类、脏器的来源无关。根据以上的结果明确了：颗粒状脱细胞组织有助于来自胎兔心脏的细 胞分化成心肌细胞和获得搏动等功能，而与其来源无关。
[0130] [表 2]
实施例3 研究颗粒状脱细胞组织的混合凝胶在大鼠心肌梗塞模型中的效果 1.颗粒状脱细胞组织的调制 由Wistar大鼠采取肝脏组织，用生理盐水清洗。清洗后，将各组织与生理盐水一起放入 聚乙稀袋中，将袋密封。使用Dr. Chef (神户制钢公司制造)在3,000~10,000atm下进行了 高静水压处理。高静水压处理后的组织用含核酸酶的清洗液和含醇清洗液清洗。清洗结束 后，将各脱细胞组织用冷冻干燥机(Eyela)进行冷冻干燥。冷冻干燥后的脱细胞组织用磨 机、食物处理机、玛瑙粉碎机(AS ONE)等粉碎。通过筛分颗粒状脱细胞组织进行处理，将直 径500μπι以下者用作颗粒状脱细胞组织。
[0131] 2.移植实验 对Wistar大鼠（雌、10-12周龄)肌肉注射0.1 mL戊巴比妥进行麻醉处理。剃去侧胸部的 毛，用聚烯吡酮碘（Isodine)消毒。在麻醉下对大鼠进行气管插管并与呼吸器连接。让大鼠 呈侧卧位，从侧胸部切开，除去肌肉层和心膜，趋近心脏。用缝合线将左冠动脉结扎，制作梗 塞部。向所制作的梗塞部滴加IOOyL含10%来自肝脏的颗粒状脱细胞组织