循环肿瘤细胞浓缩分离设备及循环肿瘤细胞的浓缩分离方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种用于从源自血液的样品中对肿瘤细胞进行浓缩分离的循环肿瘤 细胞浓缩分离设备。更详细而言，本发明设及一种能够利用比重差在离屯、分离后于肿瘤细 胞和其它的血液细胞之间由细胞分离剂形成隔壁的循环肿瘤细胞浓缩分离设备及分离方 法。
【背景技术】
[0002] 所谓循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells:CTC)是从原发性肿瘤组织或转移 性肿瘤组织中游离，并浸润到血中，由此分布在外周血中的癌细胞。运样的循环肿瘤细胞与 癌的转移性密切相关。因此，循环肿瘤细胞的检测及其动态的观察等备受关注。
[0003] 另一方面，认为循环肿瘤细胞仅W极微量存在于血液中。因此，为了检测循环肿瘤 细胞或者观察循环肿瘤细胞的动态，需要将血液中存在的循环肿瘤细胞浓缩分离至可观察 的浓度。目前，作为血液样品中的循环肿瘤细胞的浓缩分离方法，提出了各种方法。例如已 知为了除去血液细胞即红血球，在血样品整体中添加溶血剂的方法。然而，存在未发生溶血 从而残留的红血球较多运样的问题。另外，存在无法除去白血球运样的问题。此外，存在若 在源自血液的样品中添加大量的溶血剂则对目标肿瘤细胞的创伤较大运样的问题。
[0004] 在下述的专利文献1中，公开有一种使磁珠相对于循环肿瘤细胞上所表达的上皮 细胞粘附分子化pCAM)反应，将肿瘤细胞与其它的细胞磁分选，选择性地回收肿瘤细胞的方 法。在下述的专利文献2中，公开有一种使用血球分离过滤器根据细胞的大小分选肿瘤细胞 的方法。在下述的非专利文献1中，记载有一种使用了比重调整为1.077g/mL的分离剂商品 的密度梯度离屯、法。
[0005] 现有技术文献
[0006] 专利文献
[0007] 专利文献1:日本特开2012-022002号公报 [000引专利文献2:日本特开2013-042689号公报
[0009] 非专利文献
[0010] 非专利文献 1:GE Healthcare Bio-Sciences AB''Instructions 71-7167-00 AG Ficoll-Paque PLUS"
【发明内容】
[ocm]发明所要解决的技术问题
[0012] 在专利文献1中记载的方法中，只能够检测到源自上皮细胞的肿瘤细胞。因此，存 在肿瘤细胞的回收率较低运样的问题。另外，需要磁标记抗体及磁石等，操作方法繁杂。此 夕h检查需要很长时间。
[0013] 在专利文献2中记载的方法中，由于存在无法用血液分离过滤器回收的肿瘤细胞， 因此，肿瘤细胞的回收率依然较低。此外，有可能无法进行准确的浓缩分离。
[0014] 在非专利文献1中记载的方法中，在白血球由分离剂的表面扩散至下方的情况下， 有时比重局部地减少。因此，W免干扰与分离剂的界面，必须载置血液样品。因此，操作繁 杂。另外，肿瘤细胞的回收也需要谨慎的操作。此外，肿瘤细胞层和分离介质的界面不明确。 因此，肿瘤细胞的回收率较低。
[0015] 本发明的目的在于，提供一种能够解除上述的现有技术的缺点，W简便的操作、高 回收率，而且，在不提高相对于细胞的创伤性的情况下，对源自血液的样品中的循环肿瘤细 胞进行浓缩分离的循环肿瘤细胞浓缩分离设备及循环肿瘤细胞的浓缩分离方法。
[0016] 用于解决技术问题的方案
[0017] 本发明人等鉴于上述技术问题发现:通过使用具备特定比重的具有触变性的细胞 分离剂能够解决上述技术问题。即，本发明为一种循环肿瘤细胞浓缩分离设备，其用于对源 自血液的样品中存在的循环肿瘤细胞进行浓缩分离，其具备：有底的管状容器，其一端封 闭，另一端开口；具有触变性的细胞分离剂，其被收纳于上述管状容器内，上述触变性能够 在离屯、分离后，使肿瘤细胞与上述肿瘤细胞W外的血液细胞分离，上述细胞分离剂的比重 在1.050~1.080的范围内
[001引在本发明的设备的某一特定方式中，上述细胞分离剂的比重在1.055~1.080的范 围内。
[0019] 在本发明的设备的另一特定的方式中，上述细胞分离剂的比重在1.065~1.077的 范围内。
[0020] 在本发明的设备的另一特定方式中，上述细胞分离剂含有数均分子量700W上的 聚亚烷基二醇作为触变性赋予剂，且该聚亚烷基二醇W细胞分离剂整体的5重量％ W下的 浓度进行配合。
[0021] 在本发明的设备的某一特定方式中，还含有收纳于上述管状容器内的抗血液凝固 剂。
[0022] 在本发明的设备的另一特定方式中，上述循环肿瘤细胞浓缩分离设备还含有细胞 凝聚药剂，其使上述肿瘤细胞W外的血液细胞彼此选择性地凝聚并通过离屯、分离操作而沉 淀。
[0023] 在本发明的设备的另一特定方式中，上述细胞凝聚药剂是使血球细胞选择性地凝 聚的细胞凝聚药剂。
[0024] 在本发明的设备的另一特定方式中，上述细胞凝聚药剂是具有形成免疫复合体的 能力的抗体。
[0025] 在本发明的设备的另一特定方式中，上述细胞凝聚药剂的抗体具备与白血球表面 上特有的抗原结合的抗原识别部位和与红血球表面上特有的抗原结合的抗原识别部位运 两者。
[0026] 在本发明的设备的另一特定方式中，添加有上述细胞凝聚药剂，上述细胞凝聚药 剂的添加量相对于源自血液的样品ImL为25~15化L。
[0027] 在本发明的设备的另一特定方式中，上述有底的管状容器的上述开口由栓体密 封，且其内部进行了减压，构成所述栓体的至少一部分能够被刺穿。
[0028] 另外，本发明的循环肿瘤细胞的浓缩分离方法包括下述的各工序。
[0029] (1)在收纳有细胞分离剂且一端封闭且另一端开口的有底管状容器内，使源自血 液的样品、细胞凝聚药剂W及抗血液凝固剂共存的工序，所述细胞分离剂的比重在1.050~ 1.080的范围内且通过离屯、分离操作能够使上述肿瘤细胞与上述肿瘤细胞W外的血液细胞 分离，所述细胞凝药剂用于使肿瘤细胞W外的血液细胞彼此选择性地凝聚且通过离屯、分离 操作而沉淀；
[0030] (2)使该细胞凝聚药剂和该源自血液的样品在该容器内进行反应的工序；
[0031] (3)对该容器进行离屯、分离，从而在该肿瘤细胞和该其它血液细胞之间由细胞分 离剂形成隔壁的工序；
[0032] (4)对被浓缩分离至隔壁上方的血浆中的该肿瘤细胞进行回收的工序。
[0033] 发明的效果
[0034] 根据本发明的循环肿瘤细胞浓缩分离设备及浓缩分离方法，能够W简便的操作且 高回收率，W及在不提高对细胞的创伤性的情况下，对源自血液的样品中的循环肿瘤细胞 进行浓缩分离。因此，能够高效地从源自血液的样品中回收循环肿瘤细胞。
[0035] 在本发明的循环肿瘤细胞浓缩分离设备中，如上所述，由于能够W高纯度回收源 自血液的样品中极微量存在的肿瘤细胞，因此例如能够谋求使用浓缩分离的样品利用流式 细胞仪检测肿瘤细胞时的检测效率及检测精度的提高。或者，能够在显微镜下高效且高精 度地实施对浓缩分离的肿瘤细胞进行细胞学分析的操作。并且，能够W简便的操作且高回 收率且高纯度回收肿瘤细胞，由此，认为能够贡献于高效的新颖肿瘤治疗药物的开发W及 新的治疗上及诊断上的祀标的发现。
【附图说明】
[0036] 图1是示出本发明的循环肿瘤细胞浓缩分离设备的一个结构例的示意性的正面剖 视图。
[0037] 标记说明
[0038] 1…循环肿瘤细胞浓缩分离设备
[0039] 2…容器主体
[0040] 3…细胞分离剂
【具体实施方式】
[0041] 下面，通过对本发明的具体的实施方式进行说明来明确本发明。本发明所提供的 设备为对源自血液的样品中存在的极微量的肿瘤细胞进行浓缩分离的设备，该循环肿瘤细 胞浓缩分离设备的特征在于，在一端封闭，另一端开口的有底的管状容器中收纳具有触变 性的细胞分离剂，该细胞分离剂具有该肿瘤细胞和其它的血液细胞的中间比重，从而能够 通过离屯、分离操作使两者分离。
[0042] (血液细胞）
[0043] 本发明的循环肿瘤细胞浓缩分离设备能够使用后面说明的细胞凝聚药剂除去源 自血液的样品中所含的血液细胞。本说明书中的血液细胞表示除期望的肿瘤细胞W外的、 存在于源自血液的样品中的血液细胞，例如可W举出：血球细胞、血小板细胞，可更详细地 举出：红血球、B细胞、T细胞、单核细胞、NK细胞、颗粒细胞等，但并不限定于此。
[0044] (循环肿瘤细胞的比重及其它的血液细胞的比重）
[0045] 循环肿瘤细胞的比重取决于肿瘤细胞的种类，但通常为1.040~1.065左右。另一 方面，红血球的比重为1.095，白血球的比重为1.063~1.085左右。因此，循环肿瘤细胞W外 的细胞的比重通常在1.063~1.095的范围。
[0046] (源自血液的样品）
[0047] 在本说明书中的源自血液的样品中，直接使用采自被试验者的全血试样，此外，同 样地还包括例如为了保持血液的性质或者出于创造在肿瘤细胞的分离浓缩中有利的环境 等目的，添加了各种药剂的物质。
[0048] 作为源自血液的样品中所添加的药剂，可W举出：葡萄糖、麦芽糖等糖类、巧樣酸 钢等，但并不限定于此。另外，后述的抗血液凝固剂可W采取预先包含在源自血液的样品中 的构成。
[0049] (细胞分离剂）
[0050] 本发明提供一种将具有触变性的细胞分离剂收纳在一端封闭，另一端开口的有底 的管状容器中而成的设备，由此解决上述技术问题。