龟裂"。另外，在产 生油状浮游物或油膜的情况下，记载为"Δ油"。在运些情况均未观察到的情况下，标记为 〇。
[0135] 4)肿瘤细胞回收率
[0136] 将离屯、分离后被浓缩分离至隔壁上方的血浆中的肿瘤细胞通过吸液回收。DLD-1 为上皮类的细胞，因此，在回收的悬浮液中添加 CD326-FITC抗体(Miltenyi公司制造)进行 巧光标记。另外，将残留的不期望的白血球通过CD45-APC(Miltenyi公司制造)进行巧光标 记，利用流式细胞仪(FACSAria、抓公司制造），对CD326+/CD45-的细胞数进行测量，算出相 对于拟患者血中所含的肿瘤细胞数100个的回收率。将结果示于表3。
[0137] [表 3]
[013 引
[0139] 由表3可知，在实施例1~9中，细胞分离剂的流动性、隔壁强度、隔壁形成状态、月中 瘤细胞回收率均显示良好的结果。另外，在实施例10中，在隔壁形成状态的观察中，产生油 状浮游物或油膜，隔壁强度很低，但能够与实施例1~9同样地高回收率回收肿瘤细胞。在实 施例10中，认为由于添加聚氧亚烷基二醇多达10重量％，因此产生上述油状浮游物或油膜。
[0140] 相对于此，在未添加聚亚烷基二醇的实施例11中，无法得到充分的触变性而无法 得到充分的隔壁强度，但肿瘤细胞回收率良好。
[0141] 在使用了平均分子量350的聚亚烷基二醇的实施例12中，肿瘤细胞回收率良好，但 在离屯、分离后的隔壁上产生龟裂。认为即使使用平均分子量350的聚亚烷基二醇，也与实施 例11同样地无法充分地提高触变性，因此无法形成强度充分的隔壁。然而，在实施例12中， 认为无法形成强度充分的隔壁，但与实施例11同样地肿瘤细胞回收率良好。
[0142] 需要说明的是，在无法得到充分的隔壁强度或隔壁上产生龟裂的情况下，可能产 生通过分离剂所分离的血球或肿瘤细胞的漏出。因此，有可能对肿瘤细胞的回收率造成影 响或在含有所回收的肿瘤细胞的液相中混有血球。
[0143] 在将细胞分离剂的比重调整为1.045的比较例1中，流动性、隔壁强度、隔壁状态良 好，但肿瘤细胞的回收率低至39%。在将细胞分离剂的比重调整为1.085的比较例2中，即使 进行离屯、分离也无法形成隔壁。
[0144] 因此，细胞分离剂的比重优选调整为1.055~1.080。并且，由于能够W更高的回收 率得到肿瘤细胞且使细胞分离剂的流动性提高，因此细胞分离剂的比重优选调整为1.065 ~1.077。
[0145] [实施例13~18]
[0146] 对源自血液的样品和细胞凝聚药剂共存的下述的实施例13~18进行说明。
[0147] 需要说明的是，在W下的评价中，使用与实施例3相同的循环肿瘤细胞浓缩分离设 备及拟患者血。
[0148] (实施例13)
[0149] 使用RosetteSep human CD45 d邱letion cocktail(STEMCEIX Technologies公 司制造)作为细胞凝聚药剂。在W邸ΤΑ抗凝固处理后的拟患者血2mL中添加细胞凝聚药剂10 化巧μL血液ImL)并进行摇动混合，在室溫下静置20分钟后，在1200GX20分/室溫的条件下 进行离屯、分离。
[0150] 将离屯、分离后被浓缩分离至隔壁上方的血浆中的肿瘤细胞通过吸液回收。在回收 的悬浮液中通过CD326-FITC抗体(Miltenyi公司制造）及CD45-APC(Miltenyi公司制造）进 行巧光标记，利用流式细胞仪(FACSAria、抓公司制造)对CD326+/CD45-的细胞数及总细胞 数进行测量，算出相对于拟患者血中所含的肿瘤细胞数100个的回收率及残留的不期望的 肿瘤细胞W外的血液细胞数。将结果示于表3。
[0151] (实施例14~18)
[0152] 如下述的表4所示变更细胞凝聚药剂的添加量，除此W外，与实施例13同样地进行 评价。将结果示于表4。需要说明的是，表中的细胞凝聚药剂的添加量及肿瘤细胞W外的血 液细胞数换算为源自血液的样品每ImL而示出。
[0153] [表 4]
[0154]
[0155] 由表4可知，随着细胞凝聚药剂相对于源自血液的样品ImL的添加量增加，肿瘤细 胞W外的血液细胞数减少。相对于源自血液的样品ImL添加细胞凝聚药剂25化W上，由此， 肿瘤细胞W外的血液细胞数的残留数显著减少。因此，细胞凝聚药剂的添加量优选相对于 源自血液的样品ImL为25化W上。
[0156] 另一方面，在实施例13~17中，随着细胞凝聚药剂的添加量增加，肿瘤细胞W外的 血液细胞数依次减少。但是，在实施例18中，残留数稍微显示上升倾向。因此，细胞凝聚药剂 的添加量优选相对于源自血液的样品ImL设为15化W下。
[0157] 因此，细胞凝聚药剂的添加量优选相对于源自血液的样品ImL调整为SSliL~15化 L。
[015引另外，由表4的结果可知，相对于源自血液的样品ImL中的约5，300，000，000个血液 细胞，使用内包细胞分离剂的肿瘤细胞浓缩分离设备，由此，能够容易地除去源自血液的样 品中的肿瘤细胞W外的血液细胞至约2,000分之1。另外，将源自血液的样品中的细胞凝聚 试剂设为优选的添加量范围SSiiL~15化L，由此，能够容易地除去肿瘤细胞W外的血液细胞 数至约50，000分之1。在运样的情况下，肿瘤细胞的回收率也较高。
[0159]高纯度回收源自血液的样品中仅极微量存在的肿瘤细胞，由此，认为期待利用流 式细胞仪的肿瘤细胞的检测效率及检测精度的提高或者可高效且高精度地实施显微镜下 细胞学分析肿瘤细胞的操作。并且，本发明的肿瘤细胞浓缩设备能够W简便的操作来高回 收率且高纯度地回收肿瘤细胞，因此，认为对开发新且有效的肿瘤治疗药物有贡献，另外， 可W帮助发现新的治疗上及诊断上的祀标。
【主权项】
1. 一种循环肿瘤细胞浓缩分离设备，其用于对源自血液的样品中存在的循环肿瘤细胞 进行浓缩分离，其具备： 有底的管状容器，其一端封闭，另一端开口； 具有触变性的细胞分离剂，其被收纳于所述管状容器内，所述触变性能够在离心分离 后，使肿瘤细胞与所述肿瘤细胞以外的血液细胞分离， 所述细胞分离剂的比重在1.050~1.080的范围内。2. 如权利要求1所述的循环肿瘤细胞浓缩分离设备，其中， 所述细胞分离剂的比重在1.055~1.080的范围内。3. 如权利要求1所述的循环肿瘤细胞浓缩分离设备，其中， 所述细胞分离剂的比重在1.065~1.077的范围内。4. 如权利要求1~3中任一项所述的循环肿瘤细胞浓缩分离设备，其中，所述细胞分离 剂含有数均分子量700以上的聚亚烷基二醇作为触变性赋予剂，且该聚亚烷基二醇以细胞 分离剂整体的5重量％以下的浓度进行配合。5. 如权利要求1所述的循环肿瘤细胞浓缩分离设备，其还含有收纳于所述管状容器内 的抗血液凝固剂。6. 如权利要求1~5中任一项所述的循环肿瘤细胞浓缩分离设备，其还含有细胞凝聚药 剂，其使所述肿瘤细胞以外的血液细胞彼此选择性地凝聚并通过离心分离操作而沉淀。7. 如权利要求6所述的循环肿瘤细胞浓缩分离设备，其中， 所述细胞凝聚药剂是使血球细胞选择性地凝聚的细胞凝聚药剂。8. 如权利要求7所述的循环肿瘤细胞浓缩分离设备，其中， 所述细胞凝聚药剂是具有形成免疫复合体的能力的抗体。9. 如权利要求8所述的循环肿瘤细胞浓缩分离设备，其中， 所述细胞凝聚药剂的抗体具备与白血球表面上特有的抗原结合的抗原识别部位和与 红血球表面上特有的抗原结合的抗原识别部位这两者。10. 如权利要求6~9中任一项所述的循环肿瘤细胞浓缩分离设备，其添加有所述细胞 凝聚药剂，所述细胞凝聚药剂的添加量相对于源自血液的样品lmL为25~150yL。11. 如权利要求1~10中任一项所述的循环肿瘤细胞浓缩分离设备，其中， 所述有底的管状容器的开口由栓体密封，并且其内部进行了减压，构成所述栓体的至 少一部分能够被刺穿。12. -种源自血液的样品中的循环肿瘤细胞的浓缩分离的方法，其是对源自血液的样 品中的循环肿瘤细胞进行浓缩分离的方法， 该方法包括： (1) 在收纳有细胞分离剂且一端封闭且另一端开口的有底管状容器内，使源自血液的 样品、细胞凝聚药剂以及抗血液凝固剂共存的工序，所述细胞分离剂的比重在1.050~ 1.080的范围内且通过离心分离操作能够使所述肿瘤细胞与所述肿瘤细胞以外的血液细胞 分离，所述细胞凝药剂用于使肿瘤细胞以外的血液细胞彼此选择性地凝聚且通过离心分离 操作而沉淀； (2) 使该细胞凝聚药剂和该源自血液的样品在该容器内进行反应的工序； (3) 对该容器进行离心分离，从而在该肿瘤细胞和该其它血液细胞之间由细胞分离剂 形成隔壁的工序； (4)对被浓缩分离至隔壁上方的血浆中的该肿瘤细胞进行回收的工序。
【专利摘要】本发明提供一种循环肿瘤细胞浓缩分离设备，其能够简便且高回收率、以及对肿瘤细胞微创地回收源自血液的样品中的循环肿瘤细胞。一种循环肿瘤细胞浓缩分离设备，其用于对源自血液的样品中存在的循环肿瘤细胞进行浓缩分离，其中，在有底的管状容器中收纳具有触变性的细胞分离剂，所述管状容器的一端封闭，另一端开口，所述细胞分离剂的比重在1.050～1.080的范围内，能够通过离心分离操作对肿瘤细胞和所述肿瘤细胞以外的血液细胞进行分离。
【IPC分类】C12M1/26, C12N5/078, C12N5/09, G01N33/48
【公开号】CN105683353
【申请号】
【发明人】冈本隆介, 井上智雅
【申请人】积水医疗株式会社
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2014年9月30日