专利名称：对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒及制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种颗粒体病毒及制法和用途，特别涉及一种对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒及制法和用途。
利用昆虫病毒防治农林害虫是世界各国普遍使用的切实可行的灭杀农林害虫的有效措施。使用昆虫病毒来防治农林害虫，虽然具有安全、无污染，并可以长期控制害虫种群的优点，但是也存在着杀虫效率低下、作用缓慢、残效期短等一系列的缺陷。
多年来，人们一直在努力寻求对昆虫病毒具有增效作用的增效因子来解决上述缺陷。目前国外已研制出多种对昆虫病毒具有增效作用的增效因子，这些增效因子均是其它昆虫病毒(多为颗粒体病毒)的蛋白质组分，如美洲粘虫颗粒体病毒的PuGV-Sf，粉纹夜蛾颗粒体病毒的TnGV-VEF等。从目前的研究来看，这些增效因子(增效蛋白)的利用离使用阶段还非常遥远，主要是因为分离纯化的成本太高，其主要生产工艺流程通常为增殖病毒-过滤、差速离心、密度梯度离心纯化病毒颗粒体-碱解病毒颗粒体-Sephadex G-200凝胶层析-DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析，最后得到增效因子(增效蛋白)。由于其中的Sephadex G-200凝胶层析和DEAE-SepharoseCL-6B离子交换层析两个步骤成本非常之高，造成这些增效因子(增效蛋白)离实用阶段还非常遥远，无实际上的使用价值。
本发明目的在于提供一种成本低廉的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒及制法和用途，即用产于我国的东方粘虫(Pseudaletia separata)感染、驯化引进的对昆虫病毒具有增效作用的美洲粘虫颗粒体病毒PuGV，得到一种转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps，该转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps对昆虫病毒具有增效作用。
本发明实施方案如下本发明提供的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒，其特征在于为一种转寄主粘虫颗粒体病毒，于2000年09月21日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC NO.0493；本发明的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒的颗粒体形态特征为椭圆形，大小均一，长约480-720nm，宽为220-350nm，与原代美洲粘虫颗粒体病毒外形无显著差异；本发明的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒的核衣壳粒子呈杆状，常稍弯，长约300nm，宽约60nm；
本发明提供的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒的制法，其特征在于其制备步骤如下1.将由日本东京农工大学(Tokyo University of Agriculture and Technology)引进的1头感染美洲粘虫颗粒体病毒PuGV而死亡的美洲粘虫，经研磨匀浆后，以6.6×1010OB/ml的浓度给2-3龄东方粘虫口服，第1代转寄主感染死亡率小于10％；收集因感染PuGV而死亡的病虫体，并初提其病毒，继续以6.6×1010OB/ml的浓度感染2-3龄东方粘虫，如此逐代增殖，随着增殖代数的增加，东方粘虫感染PuGV病毒的死亡率稳步上升；2.在东方粘虫感染PuGV病毒的死亡率为95％时，收集被感染PuGV病毒而死亡的东方粘虫虫体，经研磨、匀浆、三层纱布过滤，滤液经差速离心，弃组织残渣并用无菌生理多次洗涤沉淀，即得到纯化的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps；3.将得到的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps进行紫外线照射后，冷冻干燥，并贮于-20℃。
所述紫外线照射的辐射量相当于普通灭菌用紫外灯(30W，波长253.7nm)距离10-20cm，照射1-1.5小时的辐射量。
该转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps对东方粘虫Pseudaletia separata的感染率同粘虫幼虫的龄期、感染病毒的剂量密切相关，选用2-3龄幼虫，用6.6×1010OB/ml的剂量口服感染时，感染率可达95％；致病的粘虫病变过程相当迟缓，病毒感染二周后才可逐渐看到虫体有明显的病变；虫体颜色变浅，腹部脂肪体累积，行动迟缓，对刺激反应微弱，逐渐停止取食；在25℃的饲养条件下，虫体死亡高峰在感染后的第四周；由于感染后期龄期延长，因而虫体比正常虫体大，请参见附图6，附图6为感染了PuGV-Ps的粘虫虫体和正常粘虫虫体的对照照片，其中A为正常粘虫虫体，B为感染后的粘虫虫体；感染病毒而死亡的幼虫体壁仍有韧性，不易触破；用相差显微镜镜检感病的组织，视野内可见迅速作布朗运动的暗黑颗粒，实际上是颗粒体病毒的颗粒体；用扫描电镜观察上述方法制得的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps，结果表明该转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps的颗粒体形态特征为椭圆形，大小均一，长约480-720nm，宽为220-350nm(见附图3)，附图3为PuGV-Ps颗粒体的扫描电镜照片，与原代美洲粘虫颗粒体病毒PuGV外形无显著差异；透射电镜观察纯化的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps的核衣壳粒子呈杆状，常稍弯，长约300nm，宽约60nm(见附图4、5)，附图4、5为PuGV-Ps颗粒体的负染电镜照片。
本发明提供的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒的用途该转寄主粘虫颗粒体病毒用于昆虫病毒的增效剂，昆虫病毒包括粘虫核型多角体病毒、棉铃虫核型多角体病毒、烟青虫核型多角体病毒、黄地老虎核型多角体病毒和松毛虫质型多角体病毒。
本发明提供的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒，对东方粘虫核型多角体病毒PsNPV、棉铃虫核型多角体病毒HaNPV、黄地老虎核型多角体病毒AsNPV和马尾松毛虫质型多角体病毒DpCPV都具有显著的增效作用。这样，我们把原寄生于美洲粘虫的颗粒体病毒PuGV驯化成寄生东方粘虫的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps。
下面结合实施例进一步描述本发明实施例1用本发明提供的方法制备本发明的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒，该对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps对粘虫核型多角体病毒(Pseudaletia separata Nuclear Polyhedrosis Virus，PsNPV)有增效作用1.将由日本东京农工大学(Tokyo University of Agriculture and Technology)引进的1头感染美洲粘虫颗粒体病毒PuGV而死亡的美洲粘虫，经研磨匀浆后，以6.6×1010OB/ml的浓度给3龄东方粘虫口服，第1代转寄主感染死亡率小于10％；收集因感染PuGV而死亡的病虫体，并初提其病毒，继续以6.6×1010OB/ml的浓度感染3龄东方粘虫，如此逐代增殖，随着增殖代数的增加，东方粘虫感染PuGV病毒的死亡率稳步上升；2.在东方粘虫感染PuGV病毒的死亡率为95％时，收集被感染PuGV病毒而死亡的东方粘虫虫体，经研磨、匀浆、三层纱布过滤，滤液经差速离心，弃组织残渣并用无菌生理多次洗涤沉淀，即得到纯化的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps；3.将得到的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps进行紫外线照射后，冷冻干燥，并贮于-20℃；所述紫外线照射的辐射量普通灭菌用紫外灯(30W，波长253.7nm)距离20cm，照射1小时。
采用口服感染的方法测定对PsNPV的增效作用。不同浓度、不同处理的药液滴加在小块的人工饲料上，每条幼虫用指形管单独饲养，待含有药液的饲料吃完后，及时更换新鲜的人工饲料；选取300条健康的4龄末东方粘虫，分三个实验组，每组100条，第1组口服本发明的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps(增效剂)，其口服量为44μg/头；第2组口服PsNPV(浓度为3.33×107PIB/ml)，其口服量为25μl/头；第3组口服PsNPV+转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps(增效剂)，口服量为每头口服PsNPV 25μl+增效剂44μg，实验重复2～3次；26℃恒温饲养，每天定时统计死亡幼虫数，并用相差显微镜镜检确证病毒的感染情况；每天定时抽样，用电子天平称量虫体的重量并记录，同时取一组相同龄期的健康粘虫在相同条件下饲养作为对照组，观察幼虫感染病毒后的生长情况；对于五龄粘虫，在口服药液后的11天内，口服转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps(增效剂)对粘虫没有致死作用，单独口服PsNPV的感染实验组死亡率只有13％，而口服PsNPV+转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps(增效剂)感染的实验组死亡率达到82％(见
图1)，
图1为PuGV-Ps(增效剂)提高PsNPV的杀虫效果曲线图；在感染后第8天，口服PsNPV+转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps(增效剂)实验组的虫体重量比单独口服PsNPV感染的实验组减少20.1％(见图2)；
图1为PuGV-Ps(增效剂)提高PsNPV的杀虫效果曲线图，图2为PuGV-Ps(增效剂)对粘虫体重影响的曲线图，其中，◆代表PuGV-Ps(增效剂)，▲代表PsNPV+PuGV-Ps(增效剂)，■代表PsNPV，●代表对照组；实施例2用本发明提供的方法制备本发明的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒，该对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps对棉铃虫核型多角体病毒(Heliocoverpa armigera Nuclear Polyhedrosis Virus，HaNPV)有增效作用的实验1.将由日本东京农工大学(Tokyo University of Agriculture and Technology)引进的1头感染美洲粘虫颗粒体病毒PuGV而死亡的美洲粘虫，经研磨匀浆后，以6.6×1010OB/ml的浓度给3龄东方粘虫口服，第1代转寄主感染死亡率小于10％；收集因感染PuGV而死亡的病虫体，并初提其病毒，继续以6.6×1010OB/ml的浓度感染3龄东方粘虫，如此逐代增殖，随着增殖代数的增加，东方粘虫感染PuGV病毒的死亡率稳步上升；2.在东方粘虫感染PuGV病毒的死亡率为95％时，收集被感染PuGV病毒而死亡的东方粘虫虫体，经研磨、匀浆、三层纱布过滤，滤液经差速离心，弃组织残渣并用无菌生理多次洗涤沉淀，即得到纯化的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps；3.将得到的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps进行紫外线照射后，冷冻干燥，并贮于-20℃；所述紫外线照射的辐射量普通灭菌用紫外灯(30W，波长253.7nm)距离10cm，照射1.5小时。
室内生物测定用4龄棉铃虫，其它方法同粘虫实验。表1的结果说明转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps(增效剂)对棉铃虫核型多角体病毒HaNPV的增效作用显著，增效幅度在80-30％之间；表1转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps(增效剂)对HaNPV的增效作用
田间实验在棉铃虫2至3龄发生高峰期，选择生长良好、受害相对均一的棉田进行实验。实验设HaNPV+增效剂(1克HaNPV+1克增效剂/亩)、HaNPV(1克/亩)两个处理和清水对照。每处理三个重复，每小区面积0.33分(22平方米)。每实验小区选5株生长健壮的棉花挂牌，喷药前检查挂牌棉株虫数，喷药后2-10天定点每天检查存活虫数，结果见表2。表2的结果表明，喷药后第5天增效可达12.5。
表2转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps(增效剂)在田间对HaNPV的增效作用
实施例3用本发明提供的方法制备本发明的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒，该对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps对松毛虫质型多角体病毒(Denarolimus spectabilis Cytoplasmic polyhedrosis viruse，DsCPV)有增效作用的实验
1.将由日本东京农工大学(Tokyo University of Agriculture and Technology)引进的1头感染美洲粘虫颗粒体病毒PuGV而死亡的美洲粘虫，经研磨匀浆后，以6.6×1010OB/ml的浓度给3龄东方粘虫口服，第1代转寄主感染死亡率小于10％；收集因感染PuGV而死亡的病虫体，并初提其病毒，继续以6.6×1010OB/ml的浓度感染3龄东方粘虫，如此逐代增殖，随着增殖代数的增加，东方粘虫感染PuGV病毒的死亡率稳步上升；2.在东方粘虫感染PuGV病毒的死亡率为95％时，收集被感染PuGV病毒而死亡的东方粘虫虫体，经研磨、匀浆、三层纱布过滤，滤液经差速离心，弃组织残渣并用无菌生理多次洗涤沉淀，即得到纯化的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps；3.将得到的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps进行紫外线照射后，冷冻干燥，并贮于-20℃；所述紫外线照射的辐射量普通灭菌用紫外灯(30W，波长253.7nm)距离15cm，照射1.2小时。
松毛虫幼虫采自江西，每组40头3龄幼虫，DsCPV的接种浓度为1.1×107PIB/mL，增效剂用量为1.7mg/mL，其它方法同粘虫实验。表3的结果说明转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps(增效剂)对松毛虫质型多角体病毒DsCPV的增效作用显著，增效幅度在59-20％之间表3转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps(增效剂)对DsCPV的增效作用
1999年5月19日于辽宁阜新地区哈尔套胜利林场进行增效剂的林间小区实验。为保证得到可靠的实验数据，采用喷药后罩笼的方法。松毛虫虫龄为4-5龄，树高为2-3米，使用手动式喷雾器，喷洒松树针叶时加1/1000的洗衣粉作粘着剂，实验共分2个处理(1)单独喷洒DsCPV(病毒浓度为7.5×1013PIB/L)；(2)DsCPV+增效剂(病毒为7.5×1012PIB/L，增效剂为0.5g/L)。
每棵树喷洒1升病毒液后，罩笼5个，每个笼内放40条松毛虫。喷药后3天逐日检查松毛虫死亡情况，实验结果见表4。表4结果表明，加入增效剂后，即使DsCPV药液稀释10倍，其防效仍高于单独使用DsCPV的21％。
表4转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps(增效剂)在林间对DsCPV的增效作用
实施例4用本发明提供的方法制备本发明的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒，该对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps对黄地老虎核型多角体病毒(Agrotis setegum Nuclear Polyhedrosis Virus，AsNPV)有增效作用的实验1.将由日本东京农工大学(Tokyo University of Agriculture and Technology)引进的1头感染美洲粘虫颗粒体病毒PuGV而死亡的美洲粘虫，经研磨匀浆后，以6.6×1010OB/ml的浓度给2龄东方粘虫口服，第1代转寄主感染死亡率小于10％；收集因感染PuGV而死亡的病虫体，并初提其病毒，继续以6.6×1010OB/ml的浓度感染2龄东方粘虫，如此逐代增殖，随着增殖代数的增加，东方粘虫感染PuGV病毒的死亡率稳步上升；2.在东方粘虫感染PuGV病毒的死亡率为95％时，收集被感染PuGV病毒而死亡的东方粘虫虫体，经研磨、匀浆、三层纱布过滤，滤液经差速离心，弃组织残渣并用无菌生理多次洗涤沉淀，即得到纯化的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps；3.将得到的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps进行紫外线照射后，冷冻干燥，并贮于-20℃；所述紫外线照射的辐射量普通灭菌用紫外灯(30W，波长253.7nm)距离18cm，照射1.5小时。
室内生物测定用3和4龄黄地老虎，其它方法同粘虫实验。表5的结果说明转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps(增效剂)对黄地老虎核型多角体病毒HaNPV的增效作用显著，增效幅度在35-15％之间；表5转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps(增效剂)对AsNPV的增效作用
权利要求
1.一种对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒，其特征在于为一种转寄主粘虫颗粒体病毒，于2000年09月21日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC NO.0493。
2.按权利要求1所述的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒，其特征在于其颗粒体形态特征为椭圆形，大小均一，长约480-720nm，宽为220-350nm，与原代美洲粘虫颗粒体病毒外形无显著差异。
3.按权利要求1所述的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒，其特征在于其核农壳粒子呈杆状，常稍弯，长约300nm，宽约60nm。
4.一种对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒的制法，其制备步骤如下1)将由日本东京农工大学(Tokyo University of Agriculture and Technology)引进的1头感染美洲粘虫颗粒体病毒PuGV而死亡的美洲粘虫，经研磨匀浆后，以6.6×1010OB/ml的浓度给2-3龄东方粘虫口服，第1代转寄主感染死亡率小于10％；收集因感染PuGV而死亡的病虫体，并初提其病毒，继续以6.6×1010OB/ml的浓度感染2-3龄东方粘虫，如此逐代增殖；2)在东方粘虫感染PuGV病毒的死亡率为95％时，收集被感染PuGV病毒而死亡的东方粘虫虫体，经研磨、匀浆、三层纱布过滤，滤液经差速离心，弃组织残渣并用无菌生理多次洗涤沉淀，得到纯化的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps；3)将得到的转寄主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps进行紫外线照射后，冷冻干燥，并贮于-20℃，即制得本发明提供的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒。
5.按权利要求1所述的对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒的制法，其特征在于，所述紫外线照射的辐射量为相当于普通灭菌用紫外灯30W，波长253.7nm，距离10-20cm，照射1-1.5小时辐射量。
6.一种对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒的用途，其特征在于，该转寄主粘虫颗粒体病毒用于昆虫病毒的增效剂，昆虫病毒包括粘虫核型多角体病毒、棉铃虫核型多角体病毒、烟青核型多角体病毒、黄地老虎核型多角体病毒和松毛虫质型多角体病毒。
全文摘要
本发明涉及一种对昆虫病毒具增效作用的转寄主粘虫颗粒体病毒,于2000年09月21日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”,保藏号为CGMCCN0.0493,其颗粒体形态特征为椭圆形,大小均一,长约480-720nm,宽为220-350nm,与原代美洲粘虫颗粒体病毒外形无显著差异,其核衣壳粒子呈杆状,常稍弯,长约300nm,宽约60nm,来自感染了美洲粘虫颗粒体病毒并用东方粘虫逐代增殖驯化虫,该转寄主粘虫颗粒体病毒用于昆虫病毒的增效剂,可提高昆虫病毒防治害虫的效率。
文档编号A01N63/00GK1351141SQ0013023
公开日2002年5月29日 申请日期2000年10月31日 优先权日2000年10月31日
发明者秦启联, 丁翠, 蔡秀玉, 刘强, 王琛柱 申请人:中国科学院动物研究所