专利名称：一种动物精子的性别分选方法
技术领域：
本发明涉及一种动物精子的性别分选方法。
家畜性别的人为控制技术较多，主要涉及的环节包括胎儿水平，如超声性别鉴别，胚胎水平，如胚胎的性别鉴定和精子水平，如体外精子性别分选。前两者均在胚胎形成后进行性别鉴定，因此，造成50％的胚胎和50％载育母体的资源浪费。同时，胚胎的体外性别鉴定，不但会对胚胎自身造成创伤，还可以导致母体的受孕率降低。所以，体外精子的性别分选和利用分选后的精子进行人工授精，生产期望性别的子代，是家畜繁殖研究工作者的一个重要课题。
几十年来，人们尝试了多种方法来分离携带X染色体的精子(雌性)和携带Y染色体的精子(雄性)，但这些方法大都缺乏良好的可靠性、重复性和准确性。流式细胞分选技术是目前公认的可靠，准确性高和高效率的精子分选方法，其原理是根据携带X染色体的精子与携带Y染色体的精子DNA含量的不同，通过荧光染色，使被激发后的X精子荧光量大于Y精子的荧光量，通过高精确度的检测和捕获系统，收集具有期望特性的精子，从而达到分选的目的(美国专利5135759 5985216 6071689)。但这一技术的不足之处是，作为商业化生产，其费用太高，同时精子分选后的活力损失较大，影响授精效果。
本发明的技术方案为一种动物精子的性别分选方法，包括以下步骤1)将动物的原精液用稀释液稀释后，进行荧光染色；2)在4℃条件下用细胞流式仪对精液进行分选，获得需要类型的精子。
分选得到的精子在4℃条件下浓缩后即可冻存备用。
为了确保被分选精子的活力，所述稀释液为在基础缓冲液的基础上加有柠檬酸钠、果糖和蛋黄中的至少一种物质，所述柠檬酸钠、果糖和蛋黄占缓冲液的重量百分比分别为0.2-1.6％、0.5-1.5％和5-25％。
其中，优选的稀释液为在基础缓冲液的基础上加有0.2-1.6％的柠檬酸钠、0.5-1.5％的果糖和5-25％蛋黄(占缓冲液的重量百分比)。
为了使精子在分选期间的溶液环境与冻存液相近，以保存精子活力，所述分选用鞘液为在基础缓冲液的基础上加有柠檬酸钠、果糖和蛋黄中的至少一种物质，所述柠檬酸钠、果糖和蛋黄占缓冲液的重量百分比分别为0.2-1.6％、0.5-1.5％和2-10％。
其中，优选的鞘液为在基础缓冲液的基础上加有0.2-1.6％的柠檬酸钠、0.5-1.5％的果糖和2-10％的蛋黄(占缓冲液的重量百分比)。
上述稀释液和鞘液中所用的基础缓冲液为多样的，只要是能够被动物细胞接受的缓冲液均可，例如可以是磷酸缓冲液、生理盐水或台式缓冲液等。
利用本发明的方法对动物精子进行分选，通过控制环境温度和分选过程中缓冲液及鞘液的组分，降低了精子的能量消耗和缓冲液对精子平衡的影响，缩短了分选后至冷冻所需的时间，在保持现有的分选精确度和分选速度的基础上，明显提高了分选后冷冻精液的活力及质量，分选周期明显缩短，分选费用显著降低，分选方法更为简单，适用于大规模的工业化生产，具有巨大的商业价值。
与现有的动物精子分选技术相比，本发明的方法具有以下几方面的突出优点1、现有的分选技术在荧光染色后，所有的操作均在室温下进行。由于分选过程所需时间较长，而在室温下，精子一直处于有力活动状态，耗能大，可导致部分精子死亡。同时精子在冷冻前，需在4℃条件下平衡2-3小时以保存精子应有的活力，因此分选周期较长。本发明巧妙地通过控制环境温度，使荧光染色后的精子，在分选前、分选中及分选后均置于4℃环境中，一方面降低了精子的活动及能量消耗，同时使精子在荧光染色后即进入必要的4℃平衡状态，显著缩短了精子在采集后至冻存所需的时间，即提高了精子成活率，又缩短了分选周期。
2、在现有的动物精子分选技术中，原精液的稀释液有含牛血清白蛋白(BSA)的Hepes缓冲液，有含有乳酸、丙酮酸、白蛋白的台氏缓冲液，有含BSA的Tris缓冲液等，但实验结果表明，精子在上述缓冲液中长时间放置，可明显影响其活力。本发明创造性地设计了含有柠檬酸钠、果糖和蛋黄的稀释液，使精子活力在分选期间内，基本上能够保持常规精液的活力。
3、在现有的动物精子分选技术中，分选用鞘液有生理盐水，磷酸缓冲液，台氏缓冲液等，其组成同冻存液相差较大，影响精子活力的维持，同时这些缓冲液均需含有0.1％-1.0％的牛血清白蛋白，且用量较大，而牛血清白蛋白价格较高，致使分选成本昂贵。本发明设计了一种含有柠檬酸钠、果糖和蛋黄的缓冲液作为鞘液，使精子在分选期间的溶液环境，与冻存液基本相近，一方面使精子活力得以保存，另一方面使分选成本得以大大下降。
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
图2为用本发明的方法分选得到的精子PCR反应后的电泳图。
在该实施例中，如果想得到Y精子，则在细胞流式仪上对精液进行Y型分选。
在该实施例中，所用的稀释液和鞘液中还可以只加柠檬酸钠、果糖和蛋黄三中物质中的一种或二种，实验结果表明，加入一种或二种物质时虽然精子的存活率及准确性略有下降，但统计学分析表明，差异不显著(P≤0.05)。
实施例2、用流式细胞分析法鉴定本发明方法精子分选的准确性将用实施例1的方法分选得到的精子用超声破碎仪去除精子的尾巴，然后再经荧光染色，在细胞流式仪上分析其分选纯度。结果如
图1所示，连续5次分选结果表明，经X分选后，X精子的纯度为92.2±3.1％(89-95％)，Y分选后，Y精子的纯度为93.5±3.8％(90-96％)。
实施例3、用PCR法鉴定本发明方法精子分选的准确性用实施例1的方法获得分选精子。将分选后的精子通过多级稀释，选取含有单一精子的试管进行PCR扩增。采用BOV97m引物特异性扩增Y染色体片段，采用利用牛1.715卫星DNA序列设计的引物扩增牛基因组DNA片段作为阳性控制。PCR扩增采用2-3级放大法，即在完成第一级35个循环的反应后，取一半反应液加入另一反应管中进行第二级35个循环的反应放大，以阳性DNA对照片段出现为有效反应。分析100个分选后精子的结果表明，如图2所示，X分选后X精子占91％，Y分选后Y精子占93％，说明本发明方法可靠、准确。
实施例4、不同分选温度对精子活力的影响取采集的新鲜奶牛精液，分为室温、4℃分选和4℃不分选三组，在实施例1介绍的缓冲液中，32℃温育40分钟后，4℃分选和4℃不分选组均置于4℃冷藏箱中，室温组置于25℃条件下，然后在预先调好的细胞流式仪上进行精液的分选，4℃分选组在4℃条件下分选，室温组在25℃条件下分选，4℃不分选组在4℃条件下平衡。分选后将所有的精子冻存，然后复温，记录存活率。
结果表明4℃不分选和4℃分选的精子存活率基本相近，分别为51.5±8.6％和48.9±9.2％。而室温组的精子存活率明显低于前者，为40.2±10.5％，说明分选期间环境温度影响精子的存活率及复温后精子的质量。
实施例5、不同精液稀释液对精子质量的影响取采集的新鲜奶牛精液，分别用含1％BSA的HEPES液，含1％BSA的台氏液和含1％BSA的Tris液及实施例1中本发明的磷酸稀释液稀释，32℃温育40分钟，置于4℃冷藏箱，然后在4℃环境经细胞流式仪分选，浓缩并冻存所有分选后的精液，再复温，记录存活率。
结果表明HEPES液精子存活率为42.6±9.8％，台氏液精子存活率为45.9±8.2％，Tris液精子存活率为38.9±12.2％，本发明稀释液精子存活率为47.6±8.9％，说明本发明所设计的稀释液不仅造价低廉，同时可保持良好的精子质量。
实施例6、不同鞘液对于分选精子质量的影响取采集的新鲜奶牛精液，分为含1％BSA的台氏液组，含1％BSA的磷酸缓冲液组和实施例1中介绍的本发明鞘液组。按照实施例1的方法用本发明的磷酸稀释液稀释，并用上述不同的鞘液在4℃环境下，经细胞流式仪分选，浓缩，冻存，然后复温，记录精子存活率。
结果表明，台氏液组精子存活率为48.6±10.2％，磷酸缓冲液组精子存活率为43.9±7.6％，本发明鞘液组精子存活率为50.8±8.9％，说明本设计鞘液不仅造价低廉，同时可保持良好的精子质量。
权利要求
1.一种动物精子的性别分选方法，包括以下步骤1)将动物的原精液用稀释液稀释后，进行荧光染色；2)在4℃条件下用细胞流式仪对精液进行分选，获得需要类型的精子。
2.根据权利要求1所述的动物精子的性别分选方法，其特征在于分选得到的精子在4℃条件下浓缩后冻存。
3.根据权利要求1或2所述的动物精子的性别分选方法，其特征在于所述稀释液为在基础缓冲液的基础上加有柠檬酸钠、果糖和蛋黄中的至少一种物质，所述柠檬酸钠、果糖和蛋黄占缓冲液的重量百分比分别为0.2-1.6％、0.5-1.5％和5-25％。
4.根据权利要求3所述的动物精子的性别分选方法，其特征在于所述基础缓冲液为磷酸缓冲液、生理盐水或台式缓冲液。
5.根据权利要求3所述的动物精子的性别分选方法，其特征在于所述稀释液为在基础缓冲液的基础上加有柠檬酸钠、果糖和蛋黄，它们占缓冲液的重量百分比分别为0.2-1.6％、0.5-1.5％和5-25％。
6.根据权利要求5所述的动物精子的性别分选方法，其特征在于所述基础缓冲液为磷酸缓冲液、生理盐水或台式缓冲液。
7.根据权利要求1或2所述的动物精子的性别分选方法，其特征在于所述分选用鞘液为在基础缓冲液的基础上加有柠檬酸钠、果糖和蛋黄中的至少一种物质，所述柠檬酸钠、果糖和蛋黄占缓冲液的重量百分比分别为0.2-1.6％、0.5-1.5％和2-10％。
8.根据权利要求7所述的动物精子的性别分选方法，其特征在于所述基础缓冲液为磷酸缓冲液、生理盐水或台式缓冲液。
9.根据权利要求5所述的动物精子的性别分选方法，其特征在于所述鞘液为在基础缓冲液的基础上加有柠檬酸钠、果糖和蛋黄，它们占缓冲液的重量百分比分别为0.2-1.6％、0.5-1.5％和2-10％。
10.根据权利要求9所述的动物精子的性别分选方法，其特征在于所述基础缓冲液为磷酸缓冲液、生理盐水或台式缓冲液。
全文摘要
本发明的名称为一种动物精子的性别分选方法。本发明的目的是提供一种动物精子的性别分选方法，用该方法分选的精子在保证分选精度的基础上，能够确保被分选后的精子活力，并且成本低，适用于商业化大规模生产。本发明的技术方案包括以下步骤1.将动物的原精液用稀释液稀释后，进行荧光染色；2.在4℃条件下用细胞流式仪对精液进行分选，获得需要类型的精子。分选得到的精子在4℃条件下浓缩后即可冻存备用。为了确保被分选精子的活力，所述稀释液及分选用鞘液均含有柠檬酸钠、果糖和蛋黄中的至少一种物质。用本发明的方法分选动物精子，明显提高了分选后冷冻精液的活力及质量，分选时间短，分选费用低，分选方法简单，适用于大规模的工业化生产，具有巨大的商业价值。
文档编号A61D19/00GK1443519SQ0210414
公开日2003年9月24日 申请日期2002年3月11日 优先权日2002年3月11日
发明者刘凤鸣, 刘世明, 贾俊英 申请人:刘凤鸣