专利名称：一种四倍体不结球白菜胞质雄性不育系的育种方法
技术领域：
本发明属作物育种领域，涉及一种四倍体不结球白菜胞质雄性不育系及相应保持系的育种方法，专用于四倍体不结球白菜胞质雄性不育系的选育。
二、技术背景不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)俗称小白菜、白菜、青菜，我国北方称“油菜”，原产中国。是我国南方最大众化的蔬菜，在蔬菜周年供应中占有举足轻重的地位。其天然种及各栽培种都是二倍体，即2n＝2x＝20。现有技术中有本发明人在国内外首次人工诱变四倍体不结球白菜“南农矮脚黄”新品种(南京农业大学学报，1990，13(2)P.33～40)；1992年育成四倍体不结球白菜杂交种“热优2号”(发明专利ZL93110536.6)。该专利品种已应用于生产。但是由于“热优2号”是由2个四倍体自交系配制的杂交种，生产种中有大量的自交种，使其F1代杂种率不能达到100％。利用雄性不育系生产F1代杂交种(即杂种优势最优化的杂交制种手段)可使F1代杂种率达到100％。目前国内外现有技术中还没有四倍体不结球白菜胞质雄性不育系，使其四倍体不结球白菜杂种优势利用受到了极大的限制。
2、以四倍体不结球白菜胞质雄性不育系C0代突变株为母本分别与保持系C0代突变株成对侧交，同时相应的保持系突变株自交，分别得到四倍体不结球白菜胞质雄性不育突变系C1代和相应的保持突变系C1代；3、选择雄性不育株率＞90％的四倍体雄性不育C1代突变系和相应的C1代保持突变系，连续侧交、驯化以恢复生活力和提高结实率、鉴定筛选雄性不育株率为100％的系统，直至C5代，同时相应的保持突变系自交至C5代，获得不育株率为100％雄性不育性稳定的四倍体不结球白菜胞质雄性不育系及相应的保持系，经细胞学鉴定，其体细胞染色体数均为2n＝4x＝40；4、上述方法选育的四倍体胞质雄性不育系及相应的保持系，在植株营养器官(根、茎、叶)和生殖器官(花器、果实等)都表现出多倍体的巨大性，统计分析表明与二倍体雄性不育系和保持系相比，差异极显著(p≤0.001)，四倍体雄性不育系雄蕊退化，即花丝极短或无，花药小，为正常花药的1/3～1/4，且不开裂，白色戟状或三角形，其内无花粉，四倍体保持系雄蕊正常，花粉染色体数n＝2x＝20；四倍体胞质雄性不育系及保持系除雄性不育形状差异外，其它经济形状相同，为普通二月白春化型，株型直立束腰，株高24～28厘米，开展度22～26厘米，叶片黄绿色、近圆形，叶柄白色、扁平，单株重0.7～1.0千克。技术效果本发明所提供的一种四倍体不结球白菜胞质雄性不育系的育种方法所育成的四倍体不结球白菜胞质雄性不育系与现有技术相比具有如下优点1、采用同时诱变雄性不育系和保持系的育种方法简单、有效、快速。如果按常规选育二倍体胞质雄性不育系的方法，需要通过远缘杂交导入不育源，再通过回交、侧交筛选保持系，一般需要6～7代。四倍体染色体比二倍体多一倍，在远缘杂交、回交、侧交过程中基因分离极其复杂，要想获得纯合基因的雄性不育系和保持系相当困难。故今未见成功报道。本发明克服了上述困难，获得成功。该项研究曾被列入江苏省“九五”农业科技重大项目(BG99501-3)资助。
2、四倍体胞质雄性不育系及相应的保持系比其二倍体在植株营养器官(根、茎、叶)和生殖器官(花器、果实等)都表现出多倍体的巨大性，统计分析表明差异极显著(p≤0.001)。四倍体胞质雄性不育系及相应的保持系株型直立束腰，株高24～28厘米，开展度22～26厘米，叶片黄绿色、近圆形，叶柄白色、扁平，单株重0.7～1.0千克。
3、四倍体胞质雄性不育系其雄性不育性彻底，不受环境条件影响，不育株率达100％。该不育系只能与四倍体不结球白菜父本系配制四倍体F1代杂交种。由于其不与二倍体不结球白菜杂交，在生产上容易寻找隔离区，可降低生产成本。
4、利用四倍体胞质雄性不育系所配制的F1代杂交种具有明显的倍性优势和杂种优势。四倍体丰产、抗病、优质不结球白菜杂交新品种选育已被列入江苏省“十五”农业科技攻关项目(BE2001321-2)。四倍体杂交种抗逆性、适应性、丰产性都显著优于二倍体雄性不育系所配制的F1代杂交种。如四倍体杂交种比二倍体杂交种增产达27％～30％。
1.2选育过程(见附
图1)1.2.1染色体倍性操作方法 1998年10月3日播种二倍体雄性不育系和保持系，在子叶期采用0.1％、0.15％和0.25％秋水仙素对其茎尖生长点分生细胞染色体进行加倍。处理时间10月11日～22日每天上午8时，下午3时，连续3天处理共6次，处理温度为22～24℃/16～18℃。每份材料处理400株，共计7200株，每份材料设对照20株。
1.2.2四倍体间接鉴定方法1、营养器官鉴定参照刘惠吉[1]的方法。总变异率＝变异株数/总株数。诱变C0代，单株选择第2～5片真叶，叶片变圆、变厚，颜色变深，株型开展正常或轻微畸形的变异株，于11月8日定植，株行距18cm×20cm。
2、气孔鉴定定植后，当植株8～10片叶完全伸展时取功能叶(以二倍体植株为对照)，用镊子迅速撕下下表皮，在99％乙醇中固定2～3秒钟，平铺于栽玻片上，加一滴1％KI溶液，盖上盖玻片，在OLYPA显微镜下进行镜检用测微尺测量气孔密度(30个视野)；气孔器长和宽(样本数N＝30)；单个保卫细胞叶绿体数量(N＝30)。并进行T测验比较二倍体与四倍体的差异。
3、花粉鉴定1999年3月开花期，取套袋隔离开放花朵散粉花药的成熟花粉，涂散在栽玻片上，直接镜检。观察花粉形状，测量花粉长和宽(N＝30)，并进行T测验比较二倍体与四倍体的差异。
4、花器及果实鉴定 用解剖镜测微尺或直接测量花蕾、花瓣、花药、花丝、子房、蜜腺、果实大小，样本数N＝30。
1.2.3四倍体直接鉴定方法1、花粉母细胞减数分裂染色体数目鉴定(见附图2) 上午8～11时取四倍体保持系花期主枝或一级分枝未开放的花序，立即放入Carnoy固定液(3份95％乙醇1份冰醋酸)中固定24h，转入70％乙醇中保存。选0.8～1.6mm花蕾，拨出花药，置于1N盐酸中，60℃水浴酸解3～5min。用醋酸洋红染色2～4min后敲片、压片，镜检。
2、根尖染色体数目鉴定(见附图3)参考杨汉民[3]去壁低渗法制备四倍体雄性不育系根尖染色体标本。
1.2.4四倍体雄性不育系选育方法1、连续测交和自交1999年3月～4月对已鉴定的四倍体雄性不育变异株C0代为母本，四倍体保持系变异株C0代为父本作成对人工测交，相应父本自交。1999年10月(人工加代)、2000年4月、2001年3月和2002年3月选择不育性高、结实稔性高和经济性状优良的系统连续测交和自交。获得C5代四倍体雄性不育系及相应的保持系。
2、结实稔性和雄性不育性测定从测交第一代开始测定雄性不育系及保持系结实稔性(用亲和指数表示)，花期亲和指数＝花期杂交30朵花所结种子数/角果数(样本数N＝10)；蕾期亲和指数＝蕾期杂交30朵花所结种子数/角果数；(样本数N＝10)。雄性不育不育株率及不育度测定参照柯桂兰[4]方法。
1.2.5四倍体F1杂交种组合品比试验2001年3月利用四倍体雄性不育系配制F1杂交组合01P-43(4X CMS×4X亮白叶)、01P-25(4X CMS×4X五月蔓)及01P-44(2X CMS×2X亮白叶)、01P-27(2X CMS×2X五月蔓)。2001年9～2002年4月进行品比试验，采用完全随机区组设计，4次重复，每小区70株，株行距20cm×20cm。试验结果进行方差分析。2结果与分析2.1秋水仙素诱变效果采用三种浓度秋水仙素对三对雄性不育系及保持系进行染色体加倍，试验结果(见表1)表明1、本试验共计获得四倍体雄性不育变异株108株，总四倍体变异率为3.0％；四倍体雄性不育保持系变异株142株，总四倍体变异率为3.9％。
2、0.15％秋水仙素的诱变效果优于0.1％或0.25％秋水仙素的诱变效果。从表1可见，随着秋水仙素浓度的增加，总变异率亦随之增加，但四倍体变异率并不相应地增加。0.1％、0.15％和0.25％秋水仙素的总变异率分别为36～47.5％、50.8～65.5％和74.5～88.3％；而四倍体变异率分别为1.5～3.5％、3.0～6.5％和2.25～4.75％。提高秋水仙素浓度可提高总变异率，但会出现大量畸形突变体，降低有效四倍体变异率。在本试验的条件下，采用0.15％秋水仙素可获得较高的四倍体加倍效果。
表1秋水仙素诱变效果比较0.1％秋水仙素 0.15％秋水仙素 0.25％秋水仙素处 变 四 总 四处 变 四 总四处 变 四 总四倍倍 倍倍 倍倍变 变变理 异 体理 异 体理 异 体材料体体体异 变 异变 异变株 株 变 株 株 变 株 株 变异异异率 率率异率 异异数 数(％) 数 数 (％) 率数 数 (％) 率株(％)株(％)株(％)98PA*-51 400 144 636.0 1.50 400 203 12 50.8 3.00 400 298 9 74.5 2.2598PA-75 400 170 10 42.5 2.50 400 235 19 58.8 4.75 400 306 13 76.5 3.2598PA-77 400 159 939.8 2.25 400 228 16 57.0 4.00 400 315 14 78.8 3.50合计Total 1200 473 25 39.4 2 08 1200 666 47 55.5 3.92 1200 919 36 76.6 3.0098PB*-52 400 161 840.3 1.75 400 218 14 54.5 3.25 400 320 10 80.0 2.5098PB-76 400 178 14 44.5 3.50 400 262 26 65.5 6.50 400 353 19 88.3 4.7598PB-78 400 190 13 47.5 3.25 400 251 21 62.8 5.25 400 325 17 81.3 4.25合计Total 1200 529 35 44.1 2.92 1200 731 61 60.9 5.08 1200 998 46 83.2 3.83注A*——雄性不育系B*——雄性不育保持系3、雄性不育系的诱变率低于其相应的保持系的诱变率，100％不育度雄性不育系的诱变率低于95％不育度雄性不育系的诱变率。由表1可见，0.1％、0.2％和0.3％秋水仙素的总变异率和四倍体变异率，雄性不育系分别为39.4％，2.08％、55.5％，3.92％和76.6％，3.0％；保持系分别为44.1％，2.92％、60.9％，5.08％和83.3％，3.83％。雄性不育系比保持系总变异率和四倍体变异率分别平均下降10％和31％；100％不育度雄性不育系98PA-51平均总变异率和四倍体变异率为53.8％和2.25％，95％不育度雄性不育系98PA-75和98PA-77的平均总变异率和四倍体变异率为58.92％和3.38％，前者比后者分别下降9..5％和50％。保持系98PA-52平均总变异率和四倍体变异率比98PA-76和98PA-78下降11.3％和71.5％。由此表明不同基因型的雄性不育系及保持系对秋水仙素诱导反应不同。2.2四倍体雄性不育系及保持系的气孔特征四倍体(4X)雄性不育系及保持系的气孔器与二倍体(2X)比较(见表2)表现出明显的巨大性及低密度，t测验差异极显著。4X雄性不育系比2X，气孔器长度增加33.64％，宽度增加34.44％。4X保持系比2X长度增加31.35％，宽度增加36.19％；气孔密度4X雄性不育系及保持系分别比2X减少90.83％和92.17％；气孔器单个保卫细胞含叶绿体数目4X雄性不育系及保持系分别比2X增加31.56％和34.48％。2.3四倍体保持系的花粉特征4X保持系成熟花粉多数为广椭圆形，长短轴之比为1.98，少数花粉呈钝角砖形(占20％～30％)，三角形、不规则畸形花粉约占5％～10％，而2X为扁椭圆形，长短轴之比为2.13；4X比2X，花粉长度增加27..14％(见表3)，宽度增加26.38％，差异极显著。试验表明，花粉的形状和大小可作为四倍体鉴定的可靠指标。
表2二倍体与四倍体叶下表皮气孔比较不育系4X比2X增保持系4X比2X增t测验 t测验4X 2X加％4X2X 加％长 3035±2.26 22.71±1.91 33.64 18.76**32.05±2.68 24.40±1.89 3135 17.62**气孔器(μ)宽 22.21±1.59 16.52±1.19 34.44 19.73**24.12±1.79 17.71±1.91 36.19 20.94**气孔密度(Num./mm2) 120±7.13 229±5.67-90.83 32.12**115±6.30221±4.17-92.17 34..36叶绿体数目/保卫细胞12.38±0.91 9.41±0.85 31.56 3.77**12.91±0.89 9.60±0.78 34.48 3.85***0.05差异显著水平，t0.05＝1.98；**0.01差异极显著水平，t0.01＝2.62；样本数N＝30。2.4四倍体雄性不育系及保持系的花器特征(见附图4)四倍体花器官各部分都呈现巨大性，t测验差异显著(见表3)。花蕾肥大，花瓣大而近圆，颜色变深。
1、4X雄性不育系及保持系花瓣长和宽比其二倍体分别增加13.75％、37.02％和17％、55.18％，形状由广扇形变为近圆形，黄色加深。4X保持系的花瓣比4X雄性不育系花瓣大，长和宽分别大19.3％和45.9％。
2、4X雄性不育系花药白色，三角形或戟形，药内无花粉。其长和宽分别比二倍体增加15.52％和24.09％，分别比4X保持系减少62.2％和49.5％，4X保持系的花药长和宽比2X分别增加17.68％和22.22％。；4X雄性不育系花丝长和宽分别比二倍体增加11.52％和19.44％，分别比4X保持系减少202.3％和39.5％。4X保持系的花丝长和宽比2X分别增加14.8％和26.36％。
3、4X雄性不育系和保持系子房差异不大，其长和宽比其二倍体分别增加9.9％、27.19％和9.34％、28.97％；4X雄性不育系和保持系花柱长比其二倍体分别增加49.26％和69.79％。
4、4X雄性不育系蜜腺4个正常，其直径比二倍体增加58.14％，但比4X保持系小16％。4X保持系的蜜腺直径比2X增加43.64％。2.5四倍体雄性不育系及保持系的果实特征四倍体的果实仍为长角果，但由于花柱膨大，在角果上端形成特有的“喙”。而二倍体的“喙”短少，随着果实成熟而枯萎。4X雄性不育系和保持系“喙”长比其二倍体分别增加133.8％和156.06％。(见表3)2.6四倍体花粉母细胞减数分裂及根尖有丝分裂染色体数目鉴定四倍体保持系花粉母细胞减数分裂试验结果表明减数分裂中期II排列在赤道板上的染色体数目为n＝2x＝20，而二倍体则为n＝x＝10。证明该保持系为四倍体，2n＝4x＝40。四倍体雄性不育系根尖有丝分裂试验结果表明有丝分裂中期排列在赤道板上的染色体数目为2n＝4x＝40，而二倍体则为2n＝2x＝20。证明该不育系为四倍体。
表3二倍体与四倍体花器及果实特征比较4X比4X比保持系不育系2X2X增t测验 t测验4X 2X增加4X 2X 加％ ％花粉粒 长 - - --49.19±1.8638.69±1.6527.1429.82**(μ)宽 - - --24.78±0.8718.17±0.9436.3825.54**花蕾长 6.26±0.755.98±0.48 4.68 2.42*6.45±0.84 6.15±0.49 4.88 2.51*(mm)宽 3.38±0.822.78±0.27 21.586.02**3.57±0.93 3.04±0.37 17.434.19**花瓣长 8.77±0.827.71±1.07 13.755.84**10.46±0.658.94±0.61 17.004.44**(mm)宽 7.07±1.045.16±0.63 37.024.82**10.32±0.776.65±0.48 55.188.27**花药长 2.01±0.181.74±0.11 15.523.62**3.26±0.32 2.77±0.19 17.684.23**(mm)宽 1.03±0.130.83±0.07 24.096.12**1.54±0.17 1.26±0.14 22.225.18**花 丝 长 2.13±0.571.91±0.21 11.525.47**6.44±0.55 5.61±0.29 14.808.88**(mm)宽 0.86±0.240.72±0.06 19.445.91**1.20±0.13 0.88±0.06 36.3617.81**子房长 5.58±0.285.08±0.31 9.90 2.61*5.97±0.18 5.46±0.22 9.34 2.59*(mm)宽 1.45±0.121.14±0.09 27.196.94**1.38±0.17 1.07±0.11 28.977.04**花柱长 3.03±0.432.03±0.13 49.267.13**3.26±0.21 1.92±0.18 6979 10.94**蜜腺直径(mm)0.68±0.070.43±0.05 58.149.79**0.79±010 0.55±0.07 43.645.05**长 55.75±4.25 49.59±3.07 12.424.95**56.27±4.1248.63±2.7415.715.04**果实宽 6.55±0.274.20±0.21 55.9516.9**6.74±0.32 4.18±0.19 61.2417.10**(mm)喙14.15±1.49 6.05±0.42 133.8 23.8**15.21±1.525.94±0.53 156.0624.45**长*0.05差异显著水平，t0.05＝1.98；**0.01差异极显著水平，t0.01＝2.62样本数N＝30。2.7四倍体雄性不育性和结实稔性四倍体雄性不育系及保持系经5代驯化选育，试验结果表明(见表4)1、四倍体雄性不育系雄性不育性稳定，不育株率为100％。其中98PTA-51系统不育度仍为100％，98PTA-75和98PTA-77系统不育度在中小株采种时为100％，大中株采种时，在春季初花期为96％，盛花期后为100％。这2个系统对春季低温轻度敏感。
2、四倍体雄性不育系及保持系结实稔低。诱变材料测交及自交第一代，平均单角果结籽数小于1，即4X雄性不育系最高的蕾期亲和指数为0.56～0.72，保持系为0.67～0.81。试验测定的实际范围为0.08～0.81。随着驯化代数增加单亲和指数逐渐提高。测交及自交第五代，4X雄性不育系最高的蕾期和花期亲和指数分别上升至8.24～10.37和5.32～7.26，保持系为7.56～8.42和5.09～5.18；由表4又见，98PTA-51系统不育系的亲和指数比98PTA-77系统低。保持系的亲和指数在前三代高于不育系，而在后两代低于不育系。
表4四倍体雄性不育性及结实稔性年/月材料蕾期亲和指数 花期亲和指数 年/月不育株率(％) 不育度(％)1999/03 98PTA-51-1 0.56 -1999/10 10010098PTA-75-7 0.72 -10010098PTA-77-3 0.64 -- -98PTB-52-1 0.67 -0 098PTB-76-1 0.81 -0 098PTB-78-4 0.70 -- -1999/11 98PTA-51-1-2 1.28 -2000/04 10010098PTA-75-7-5 1.76 -10010098PTB-52-1-8 2.04 -0 098PTB-76-1-3 2.35 -0 02000/04 98PTA-51-1-2-5 3.84 1.07 2001/03 10010098PTA-75-7-5-3 4.53 1.88 1009698PTB-52-1-8-2 4.05 1.79 0 098PTB-76-1-3-125.95 2.12 0 02001/03 98PTA-51-1-2-5-10 5.12 2.41 2002/03 10010098PTA-75-7-5-3-9 6.21 2.57 1009698PTB-52-1-8-2-7 4.89 2.32 0 098PTB-76-1-3-12-6 6.02 3.15 0 02002/03 98PTA-51-1-2-5-10-68.24 5.32 - - -98PTA-75-7-5-3-9-1610.37 7.26 - -98PTB-52-1-2-5-10-87.56 5.18 - -98PTB-76-1-3-12-6-18.42 5.09 - -2.8四倍体雄性不育系及保持系农艺形状四倍体雄性不育系及保持系农艺学形状除雄性不育形状外，其它形状相同为普通二月白春化型，株型直立，束腰，株高24～28厘米，开展度22～26厘米，叶片黄绿色、近圆形，叶柄白色、扁平，单株重0.7～1.0千克。(见附图5)2.9四倍体F1杂交种组合品比试验表5四倍体与二倍体F1杂交组合比较单位Uniteg cm小区产材料株高 开展度 叶形 叶片重 十叶厚 叶柄重 叶柄厚 单株重量(kg)近圆01P-43 30.0*29.8*262.8**0.68**467.0**0.60**729.8**51.61**卵圆01P-44 27.8 27.8 208.30.49 372.30.45580.6 40.80近圆01P-25 25.5*25.3*223.5**0.72**419.5**0.62**643.0**44.12**卵圆01P-27 23.5 24.5 183.5 0.60 326.80.50510.3 33.87*0.05差异显著水平；**0.01差异极显著水平。利用四倍体和二倍体雄性不育系配制F1杂交种组合品比试验(见表5)表明四倍体0杂交种具有明显的杂种优势和倍性优势，植株高大，叶形变圆变大，厚度增加，单株重增加。二、四倍体杂交种各子性状差异显著至极显著。叶片厚度四倍体比二倍体分别增加20％和38.8％；叶柄厚度分别增加24％和33.3％；小区产量01P-43比01P-44增加26.5％，01P-25比01P-27增加30.3％。
权利要求
1.一种四倍体不结球白菜胞质雄性不育系的育种方法，其特征在于1)诱变四倍体用的秋水仙素溶液浓度为0.1％(g/ml，下文同)、0.15％和0.25％，在子叶期处理二倍体不结球白菜胞质雄性不育系及相应的保持系(2n＝2x＝20)的茎尖生长点分生细胞，连续处理3天，每天2次，处理温度为昼22～24C/夜16～18℃，筛选出第一代四倍体不结球白菜胞质雄性不育系及相应的保持系突变株C0代，与未处理对照相比，C0代特征为植株生长缓慢，叶片近圆形且厚、颜色深黄绿色，叶片下表皮气孔保卫细胞大，气孔密度小，花器官大，花瓣圆，颜色深黄，不育系与保持系区别在于前者表现雄性不育，后者雄性可育；2)以四倍体不结球白菜胞质雄性不育系C0代突变株为母本分别与保持系C0代突变株成对侧交，同时相应的保持系突变株自交，分别得到四倍体不结球白菜胞质雄性不育突变系C1代和相应的保持突变系C1代；3)选择雄性不育株率＞90％的四倍体雄性不育C1代突变系和相应的C1代保持突变系，连续侧交、驯化以恢复生活力和提高结实率、鉴定筛选雄性不育株率为100％的系统，直至C5代，同时相应的保持突变系自交至C5代，获得不育株率为100％雄性不育性稳定的四倍体不结球白菜胞质雄性不育系及相应的保持系，经细胞学鉴定，其体细胞染色体数均为2n＝4x＝40；4)上述方法选育的四倍体胞质雄性不育系及相应的保持系，在植株营养器官(根、茎、叶)和生殖器官(花器、果实等)都表现出多倍体的巨大性，与二倍体雄性不育系和保持系相比，经统计分析，差异极显著(p≤0.001)，四倍体雄性不育系雄蕊退化，即花丝极短或无，花药小，为正常花药的1/3～1/4，且不开裂，白色戟状或三角形，其内无花粉，四倍体保持系雄蕊正常，花粉染色体数n＝2x＝20；四倍体胞质雄性不育系及保持系除雄性不育形状差异外，其它经济形状相同，为普通二月白春化型，株型直立束腰，株高24～28厘米，开展度22～26厘米，叶片黄绿色、近圆形，叶柄白色、扁平，单株重0.7～1.0千克。
全文摘要
本发明为一种四倍体不结球白菜胞质雄性不育系的育种方法，用0.1％(g/ml，下文同)、0.15％和0.25％秋水仙素处理二倍体不结球白菜胞质雄性不育系及相应的保持系，以四倍体不结球白菜胞质雄性不育系突变株为母本与相应的保持系突变株连续侧交5代，同时相应的保持系突变株自交，经选育驯化获得雄性不育性稳定的四倍体不结球白菜胞质雄性不育系及相应的保持系。该雄性不育系不育株率为100％，株型直立、束腰、白梗、黄绿色近圆叶、单株重0.7～1.0千克，体细胞染色体数2n＝4x＝40。该系统是生产四倍体杂交种最优化的制种手段。
文档编号A01H3/04GK1443442SQ0311328
公开日2003年9月24日 申请日期2003年4月25日 优先权日2003年4月25日
发明者张蜀宁, 刘惠吉, 李式军 申请人:南京农业大学