专利名称：双歧杆菌和含有它们的制品的制作方法
技术领域：
本发明涉及长双歧杆菌的非致病性微生物在辅助胃肠保健且特别是在预防和/或治疗胃肠道不适、尤其是肠不适中的应用。
背景技术：
长时间以来已得知被用作对食品防腐或制备如酸牛奶这样的乳品或其它乳制品的发酵剂的许多类型细菌；这些细菌一般称作“乳酸菌”且包括许多属，如乳球菌属、乳杆菌属、链球菌属、双歧杆菌属和片球菌属。
近来这些细菌已经成为更为关注的对象，这是因为当吞咽下这些细菌时，它们表现出对人和动物的显著特性；特别是有时联合施用的乳杆菌属或双歧杆菌属的菌株已经通过防止其它有害微生物定居而在定居肠粘膜和辅助人体保健方面表现出功效，正如美国专利US5,494,664和US 6,241,983以及国际专利申请WO 0033854和WO0110453中所证实的。
这些微生物也称作“益生菌”且对其有益作用的基本需求在于它们可以以一定的数量和一定的活力到达粘膜，使得它们能够持续并定居在肠道，因此，它们必须适当耐受胃中的低pH。
在如便秘或腹泻和使用抗生素治疗后这样的肠不适的情况下，即特别是在促使肠菌群缺乏的所有情况下且在摄取的食物中缺乏纤维、环境条件或应力降低肠菌群活力时的所有情况下推荐指定的益生菌产品。
为了恢复人体菌群中天然存在的微生物的适宜水平，使用完全定性的并提取自健康人体的菌群的细菌菌株是这类施用的目标。
外源性微生物在肠中的定居活性取决于其浓度、其定居能力和它们在肠中找到的环境条件，因为给予更大量、高定居能力和适宜的环境条件有助于它们通过定居在肠中的大部分区域而起到防护和治疗作用，却不会因为它们是天然来源的产物而产生副作用。特别必须强调的是可能存在的例如菊糖或低聚果糖类这样的营养纤维主要辅助所述的定居，因为这些化合物是益生菌的底物且由此它们增加定居的机会。所述的寡糖类因这种与益生菌的协同作用也称作“益生素”。
发明内容
本发明的主题是命名为W11和W11a的寄存在比利时微生物协作保藏中心(Belgian Coordinated Collections ofMicroorganisms)-BCCM LMG-保藏中心的长双歧杆菌的两个菌株的生物纯培养物，其中BCCM LMG-保藏中心已经给上述两个菌株登记了保藏号LMG P-21586和LMG P-21587；上述生物纯培养物作为药物或营养型制品中的益生菌的应用；和含有它们的用于辅助胃肠保健并预防和治疗肠道疾病的药物或营养型制品。
已经从健康人的肠菌群中分离出了长双歧杆菌的两个菌株W11和W11a且在同期分离的许多其它长双歧杆菌菌株中筛选出了它们，因为它们已经表现出在肠菌群上的定居能力和粘着肠细胞的能力，这两个特征使得它们成为能够辅助胃肠道良好健康状态和由不同起因的胃肠炎中恢复其被改变的功能的良好益生菌。
首先在实验室中且随后在工业化制备中生产了本发明主题的细菌培养物且它们由已经在37℃下和适宜的培养基中生长了20小时的纯菌株制成，所述的适宜培养基称作TPY，它含有作为主要成分的胰蛋白酶酪蛋白胨、大豆胨、酵母抽提物和葡萄糖并含有钾、钙、镁和锌的盐。
已经由这些初级培养物制备了随后的传代培养物，目的在于增加纯菌株的数量，直到获得被用作用于两种益生菌长双歧杆菌W11和W11a的细菌培养物的工业化生产的接种物的菌母为止。
所述细菌培养物的工业化生产方法包括下列步骤
1.在控制在5.5-7.5的pH下发酵；2.通过离心从培养物肉汤中分离细菌生物质；3.在添加选自蛋白、碳水化合物和无机盐的适宜低温保护剂后冻干所述的细菌生物质以便在冷冻和冻干步骤中保护细胞的活力，可能还需要在增加菌株耐受酶降解和酸性pH条件的能力范围内添加蛋白沉淀剂；4.磨碎冻干的培养物并使之成粒。
按照本领域技术人员所公知的细菌计数的微生物学方法进行的分析，例如在Ison A.P.和Matthew G.B.的应用微生物生理学(Applied Microbial Physiology)中的“一种实施手段”(apractical approach)，Rhodes P.M.和Stanbury P.F.Editors-IRL Press Oxford，103-130，1997中所报道的，如此制备的产物含有约1×1010-约1×1012个长双歧杆菌W11或W11a的活细胞的平均值/克终产物。
已经在带有阳性结果的小鼠肠中的定居试验中检验了所述的细菌培养物，此时，长双歧杆菌LMG P-21586或LMG P-21587的细菌加载量的计数已经显示出高于1×106个活细胞/克小鼠粪便的值。
确切地说作为主要目的，本发明的另一个目的是获自长双歧杆菌W11或W11a菌株的生物纯培养物作为辅助胃肠保健并预防和治疗肠疾病的药物或营养型制品中的益生菌的用途，其中所述的肠疾病如腹泻、不同起因的胃肠炎、便秘、肠过敏、憩室病和肠的慢性炎症性疾病。
可以通过向含有长双歧杆菌W11或W11a的细菌培养物的药物或营养型制品中添加难消化的寡糖类形式的营养纤维来提高含有长双歧杆菌W11或W11a的细菌培养物在辅助肠道保健中的功效，所述的难消化的寡糖类例如有低聚果糖类或菊糖，它们在肠道上部既不会被吸收也不会被水解并可强化所述的活性且刺激长双歧杆菌LMG P-21586和LMG P-21587菌株的代谢至对致病菌不利。在实施本发明过程中优选的寡糖类是由存在于葡萄糖分子(G)中的基本单元构成的具有2-20的聚合度、即一定数量的单糖单位的低聚果糖的混合物，其中所述的葡萄糖分子(G)与通式GFn的果糖分子(F)链结合，其中，n≤4。用作与本发明主题的两种类型益生菌混合的益生素的低聚果糖类具有2-10、优选3-6的聚合度。
本发明主题的制品可以含有维生素、优选E、B1、B2、B6和B12族维生素以及各种赋形剂，如增甜剂，例如天冬甜素、甘露糖醇或山梨醇；调味剂；和着色物质；这些制品具有通过恢复在肠道疾病过程中显著减少的维生素成分而进一步提高健康的能力。
本发明的目的是含有称作W11和W11a且LMG P-21586或LMGP-21587保藏号登记的长双歧杆菌的细菌培养物的药物制剂和营养产品，它们可选地含有益生素，优选低聚果糖类或菊糖和/或维生素、优选E、B1、B2、B6和B12族维生素。
所述的药物制剂优选由可通过口服途径给药的组合物制成，其剂型有胶囊、片剂、袋装制剂、锭剂、液体混悬剂、干口服补剂、液体口服补剂、瓶装制剂等，它们含有稳定期结束时1×107-1×1011个长双歧杆菌W11或W11a的活细胞的细菌加载物。
所述的药物制剂还可以含有益生素，如低聚果糖或菊糖，优选每个剂量含有0.5-5g的低聚果糖、更优选1-3g；和/或维生素，优选E、B1、B2、B6和B12族维生素。
还可以在许多类型的营养产品的生产过程中混入1×107-1×1011个活细胞量的长双歧杆菌益生菌，所述的营养产品如乳品；酸奶；新鲜干酪，如乳清干酪、斯特拉希诺干酪和莫泽雷勒干酪(意大利干酪类)；冰淇淋；由发酵乳品制成的产品；由发酵谷物制成的产品；奶粉；儿童产品和家养动物产品。
对细菌计数检验的测试已经证实作为本发明目的的长双歧杆菌的两个菌株是耐受性的，因此它们在药物或营养制品生产的工艺过程中或在其储存的整个正常期限中不会发生大量死亡。实际上，已经将这些细菌制品提交进行稳定性试验，该试验显示两个细菌菌株在室温下具有极佳的耐受性，使得它们在制成后的销售期不少于2年。
下文报导的实施例用于进一步解释本发明但不应看作是对本发明的限定。
实施例1长双歧杆菌W11菌株的细菌培养物的生产方法用作工业化发酵中的接种物的长双歧杆菌W11菌株的“初级培养物”确实与寄存在比利时微生物协作保藏中心(BelgianCoordinated Collections of Microorganisms)-BCCM LMG-保藏中心-Laboratorium voor Microbiologie，Universiteit Gent的菌株相同，BCCM LMG-保藏中心在接受送达的该菌株时已经确认了该菌株的纯度和活力并已经登记了其保藏号为LMG P-21586。
为了得到这种“初级培养物”，将所述的菌株培养在称作TPY的含有下列组成的培养基中，以1升为准酪蛋白的胰蛋白酶胨 10g大豆胨 5g酵母抽提物 5g葡萄糖 10g无水K2HPO42gMgCl2·6H2O 0.5gZnSO4·7H2O 0.25gCaCl2·2H2O 0.15gTween 80 1ml盐酸半胱氨酸 0.5g双蒸水 适量至1000ml在37℃下使培养进行20小时且然后将该培养物分装入管形瓶，向其中添加选自蛋白、碳水化合物和无机盐的适宜低温防护剂，然后将管形瓶冷冻并储存在-196℃下的液氮中。
由接种物百分率为3％的该“初级培养物”作为原料制备3种传代培养物，目的是为了增加所述细菌菌株的细胞数量。
将称作“菌母”的约10升最后传代培养物用于给具有约300升容量的“即刻培养物”反应器接种。
随后的长双歧杆菌W11的生物纯培养物的工业化生产过程包括下列步骤1.在控制在6.5-7.0的pH下发酵；2.从培养物肉汤中分离细菌生物质；3.通过添加选自蛋白、碳水化合物和无机盐的适宜低温防护剂溶液保护所述的细菌生物质以便在以后的冷冻和冻干步骤中保护细胞的活力，且可能还需要包括添加蛋白沉淀剂，目的在于使所述菌株耐受酶降解和酸性pH条件；4.冻干；5.磨碎冻干的培养物并使之成粒；6.掺合冻干的培养物；7.包装。
所得的产物含有约8-10×1010个活细胞/克。
实施例2长双歧杆菌W11a菌株的细菌培养物的生产方法按照实施例1中所述的方法、通过以确实对应于寄存在比利时微生物协作保藏中心(Belgian Coordinated Collections ofMicroorganisms)-BCCM LMG-保藏中心-Laboratorium voorMicrobiologie，Universiteit Gent的长双歧杆菌菌株的“初级培养物”作为原料制备了长双歧杆菌W11a的生物纯的细菌培养物，BCCM LMG-保藏中心在接受送达的该菌株时已经确认了该菌株的纯度和活力并已经登记了其保藏号为LMG P-21587。
实施例3体内定居试验对各含2只小鼠的4组小鼠进行试验，每只小鼠接受2次剂量的含有浓度等于1.6×109CFU/60μl的长双歧杆菌LMG P-21586的葡萄糖溶液，第一次剂量后16小时给予第二次剂量。
通过计算存在于粪便中的长双歧杆菌的量检验了所述菌株在这些小鼠肠中定居的能力在开始给药前进行第一次取样，而在第二次给药后的2、4、8、24、48小时分别进行随后的取样。在粪便中发现的长双歧杆菌菌株的量在106CFU/g左右，由此表明定居发生。特别发现相对于在粪便中发现的双歧杆菌的所有菌株而言长双歧杆菌是得到的菌群中的主要成分。
实施例4装有低聚果糖类和维生素的袋装制品将袋装制品作为实施例报导，它们各自重3g、可以在水或奶中溶解且含有相当于约2×1010个长双歧杆菌W11的活细胞、2500mg的低聚果糖类和B1、B2、B6和B12族维生素的250mg生物纯的细菌培养物。
将商购称作Actilight950P的由通过与n≤4并具有2-10的聚合度的通式GFn的一个葡萄糖分子连接的果糖分子链形成的低聚果糖类混合物构成的产品特别被用作低聚果糖。
该袋装组分的具体成分-含量如下
制备方法第一步将维生素与等份的Actilight950P进行混合，随后在净孔径为0.5mm的筛上过筛。将这第一步的混合物加入到第二个等份的Actilight950P中并进行第二个混合步骤。最后加入长双歧杆菌W11的细菌培养物、剩余等份的Actilight950P和制品中的其它成分，同时进行进一步的混合，随后在0.8mm的筛上进行最终的过筛。
然后将产品分装入重3g的铝袋中。该铝袋的制备工艺过程不会对所述菌株的活力产生任何损害。
稳定性试验通过在0时且分别在22℃下储存1、2和3个月后测定细菌加载量对所述袋进行稳定性试验，由此确定半衰期。在1、2和3个月后的数据分析表明在这些期限中死亡率极低，从而使2年后就每个剂量而言上述袋装制品中活细胞的数量不低于5×109个细胞。所述的结果表明该制品足以达到本发明需要达到的水平。
实施例5装有维生素的软胶囊制剂已经通过以下步骤制备了具有下列成分-含量的软胶囊
制备长双歧杆菌W11的细菌培养物、维生素、大豆卵磷脂和脂肪酸的单和二甘油酯溶于大豆油的均匀混悬液；将所述的混悬液分装入由营养明胶、甘油、二氧化钛和黄色氧化铁制成的7.5号大小的椭圆形胶囊中且随后在约21℃的温度和约20％的湿度下的气流中干燥。
权利要求
1.由长双歧杆菌的菌株LMG P-21586制成的生物纯培养物。
2.由长双歧杆菌的LMG P-21587菌株制成的生物纯培养物。
3.权利要求1和2中之一的生物纯培养物作为用于辅助胃肠保健并预防和治疗肠道疾病的药物或营养型制品中的益生菌的用途。
4.含有来源于由长双歧杆菌菌株LMG P-21586制成的生物纯培养物的1×107-1×1011个活细胞的细菌加载物的药物或营养型制品。
5.含有来源于由长双歧杆菌菌株LMG P-21587制成的生物纯培养物的1×107-1×1011个活细胞的细菌加载物的药物或营养型制品。
6.权利要求4和5中之一的制品，其特征在于它们含有寡糖形式的益生素。
7.权利要求6的制品，其特征在于所述的寡糖是具有2-10聚合度的低聚果糖或菊糖。
8.权利要求4-7中之一的制品，其特征在于它们含有维生素。
9.权利要求8的制品，其特征在于所述的维生素是维生素E、B1、B2、B6和B12。
10.权利要求4-9中之一的制品，其特征在于它们选自胶囊、片剂、袋装制剂、锭剂、液体混悬剂、干口服补剂、液体口服补剂、瓶装制剂、乳品、酸牛奶、新鲜干酪、冰淇淋、由发酵谷物制成的产品、奶粉、儿童产品和家养动物产品。
全文摘要
本发明涉及命名为W11和W11a并寄存在比利时微生物协作保藏中心(Belgian Coordinated Collections of Microorganisms)(BCCM)的长双歧杆菌的两个菌株的生物纯培养物，其中BCCM已经给上述两个菌株登记了保藏号LMG P－21586和LMG P－21587；本发明涉及上述生物纯培养物作为药物或营养型制品中的益生菌的用途并涉及含有它们的用于辅助胃肠保健并预防和治疗肠道疾病的药物或营养型制品。
文档编号A23K1/18GK1480528SQ0317840
公开日2004年3月10日 申请日期2003年7月15日 优先权日2002年9月6日
发明者G·C·威斯科米, G C 威斯科米, L·G·罗蒂尼, 罗蒂尼, ＠, L·莫埃里, P·费拉里, 潘塔里奥, M·R·潘塔里奥 申请人:阿尔法·瓦瑟曼公司, 阿尔法 瓦瑟曼公司