新的产生spinosyn的聚酮合酶的制作方法

专利名称：新的产生spinosyn的聚酮合酶的制作方法
发明概述本发明提供了新的杂化聚酮(polyketide)合酶(PKSs)，编码这种PKSs的DNA，整合有该杂化聚酮合酶DNA的载体，用该杂化聚酮合酶DNA转化的宿主生物包括但不限于刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)菌株，使用该杂化聚酮合酶DNA来改变产生spinosyn的菌株制备的产物的方法，和由这些操作产生的新的生物活性化合物。
背景技术：
如美国专利5,362,634公开的，发酵产物A83543是由刺糖多孢菌产生的相关化合物家族。美国专利6,274,350B1和WO 01/19840中描述了以前已经分离的天然spinosyn化合物家族，连同在各种昆虫控制试验中它们的活性。美国专利6,001,981中也描述了很多半合成spinosyn类似物，其中以各种方法成功取代了spinosyn分子的化学可接近区域。
这个家族的已知成员已被称作因子或成分，并且对每种分配了一个用于鉴别的字母。以下将这些化合物称作spinosyn A，B，等。该spinosyn化合物可有效控制蛛形纲动物、线虫和昆虫，尤其是鳞翅目和双翅目物种，并且它们对环境相当友好，具有有吸引力的毒理学特性。商品化产品多杀菌素(Spinosad)是spinosyn A和D的混合物(Pesticide Manual，11th ed.，p.1272)。
表1和2鉴定了一些已知spinosyn化合物的结构
表1 表2
天然产生的spinosyn化合物由与12员的大环内酯稠合的5，6，5-三环系统、中性糖(鼠李糖)和氨基糖(福洛氨糖(forosamine))组成(见Kirst等(1991)。如果化合物中不存在氨基糖，则该化合物被称作A，D的假糖苷配基等，和如果不存在中性糖，那么该化合物被称作A，D的反向假糖苷配基等。更优选的命名法是将假糖苷配基称作spinosyn A17-Psa，spinosyn D 17-Psa，等，和将反向假糖苷配基称作spinosyn A9-Psa，spinosyn D 9-Psa等。
天然产生的spinosyn化合物可以通过从培养物NRRL 18395，18537，18538，18539，18719，18720，18743和18823发酵来制备。这些培养物已经保藏并且构成Midwest Area Northern Regional ResearchCenter，Agricultural Research Service，United States Departmentof Agriculture，1815 North University Street，Peoria，IL 61604原始培养物保藏的一部分。
美国专利5,362,634和相应的欧洲专利申请375316 A1公开了spinosyns A，B，C，D，E，F，G，H，和J。公开了这些化合物由培养选自NRRL 18395，NRL 18537，NRRL 18538和NRRL 18539的新微生物刺糖多孢菌菌株产生。
WO 93/09126公开了spinosyns L，M，N，Q，R，S和T。其中也公开的是两个产生spinosyn J的菌株NRRL 18719和NRRL 18720，和产生spinosyns Q，R，S，和T的一个菌株NRRL 18823。
WO 94/20518和美国专利5,670,486公开了spinosyns K，O，P，U，V，W和Y，及其衍生物。也公开的是产生spinosyn K的菌株NRRL 18743。
WO 01/19840公开了由培养糖多孢菌种LW107129(NRRL 30141)产生的spinosyn类似物。
WO 99/46387和美国专利6,143,526公开了来自刺糖多孢菌的spinosyn生物合成基因。
Spinosyn生物合成中涉及的基因的性质，连同前体并入的以前研究(Broughton等，1991)，表明spinosyns是由2-碳和3-碳羧酸逐步缩合产生环化和桥接的聚酮产生的。这些反应的四环、糖苷配基产物通过添加鼠李糖基残基转变为假糖苷配基，通过添加二-N-甲基化糖即福洛氨糖(forosamine)来完成合成。在有些方面，这个过程类似于产生其它大环内酯(如抗生素红霉素、抗寄生虫阿弗菌素和免疫抑制剂雷帕霉素)的生物合成途径。尤其是，聚酮化合物核心是由很大的多功能蛋白装配起来的，那是I型聚酮合酶(spn PKS)。这个多肽复合物包括一个装载模块(loading module)和十个延伸模块(extension module)，每个模块负责特定酰基-CoA前体添加到正在生长的聚酮化合物链，以及β-酮基羰基的还原程度。每个模块执行几种生物化学反应，这些反应是由该多肽的特定结构域实施的。所有延伸模块含有向酰基载体蛋白(ACP)提供前体的酰基的酰基转移酶(AT)结构域，和通过脱羧缩合给新的酰基-ACP添加预先存在的聚酮链的β-酮合酶(KS)结构域。一些延伸模块还存在另外的结构域将β-酮基还原为羟基的β-酮还原酶(KR)结构域，除去羟基留下双键的脱水酶(DH)结构域，和将双键还原留下饱和碳的烯酰还原酶(ER)结构域。spn PKS的装载模块不同于延伸模块，因为它含有变异KS结构域(KSq)，以及AT和ACP结构域。KSq结构域，在一些其它的I型PKS装载模块(但不是所有)中也发现了它，据信它提供ACP-结合酰基链脱羧的必需起始单位(Bisang等，1999)。末端延伸模块含有使聚酮链从PKS释放的硫酯酶/环化酶(TE)结构域。
spinosyn PKS DNA区域由5个ORFs组成，符合读框(in-frame)的终止密码子在一些ACP结构域的末端，类似于其它产生大环内酯的细菌中的PKS ORFs。这五个spinosyn PKS基因头尾排列，没有任何插入的非PKS功能，如在红霉素PKS基因AI和AII之间发现的插入元件(Donadio等，1993)。它们命名为spnA，synB，spnC，spnD，和spnE。美国专利6,143,526和Waldron等，2001中鉴定了这五个spinosyn PKS基因中的每一个的核苷酸序列和相应的多肽。这些来源中也鉴定的是PKS基因的预测翻译产物，和结构域和模块的边界。
在它合成之后，spinosyn聚酮前体缩合形成大环内酯，以下称作聚酮化合物核心。杀虫活性的spinosyns的产生需要另外加工聚酮化合物核心。首先，C3和C14，C4和C12，以及C7和C11之间应该形成碳-碳桥，产生糖苷配基中间体。(Waldron等，2001)已经提示了这些罕见反应的可能机制，但是不知道它们发生所需要的聚酮底物的结构特征。其次，在C9应该并入三-O-甲基鼠李糖以产生假糖苷配基。尚不知道鼠李糖在其添加到糖苷配基之前还是之后被正常甲基化，但是刺糖多孢菌能够在鼠李糖部分已连接到糖苷配基后添加甲基基团(Broughton等，1991)。甲基化应该以特定顺序发生(2′然后3′然后4′)或不是它们的全部都发生，表明甲基转移酶具有非常特异的底物需要。第三加工步骤中，在C17添加福洛氨糖(forosamine)，是产生最具活性的spinosyn所需的。这个步骤中涉及的酶也具有严格的底物需要福洛氨糖基(forosaminyl)转移酶将不使用糖苷配基作为底物，且在福洛氨糖连接到假糖苷配基之后，N-甲基转移酶将不对福洛氨糖(forosamine)作用。后一生物合成酶的这一底物特异性可能是从具有不同化学结构的前体产生新的生物活性spinosyns的障碍。
在某些情况下，以前对聚酮合酶(PKS)的基因进行了操作已提供新的聚酮化合物。已经表明框内删除编码产生红霉素(ery)PKS的模块5中的KR结构域的一部分的DNA导致红霉素类似物的形成，即5，6-双脱氧-3α-碳霉糖基(mycarosyl)-5-oxoerythronolide B和5，6-双脱氧-5-oxoerythronolide B(Donadio等，1991)。同样地，通过相应的编码PKS的DNA的基因工程改造造成ery PKS的模块4的ER结构域中活性部位残基的改变，接着将其导入红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)，导致6，7-脱水红霉素C(Donadio等，1993)的产生。WO 93/13663描述了能够产生改变的聚酮化合物的另外类型的ery PKS基因的基因操作。
WO 98/01546公开了用来自阿弗菌素(ave)PKS的装载模块取代eryPKS的装载模块，产生杂化I型PKS基因，它并入了不同起始单位来形成新的红霉素类似物。
然而，也已经发现不是所有的PKS基因操作都产生所需新类似物。当Donadio等(1993)灭活ery PKS的ER结构域时，所得脱水衍生物不能完全加工，因为它不再是碳霉糖(mycarose)-O-甲基转移酶的底物。改变聚酮化合物起始单位可以阻止地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsismediterranei)中利福霉素类似物的完全延伸和加工(Hunziker等，1998)。假定延伸底物特异性加工是产生杀昆虫活性的spinosyns所需的，改变spinosyn聚酮化合物结构的基因操作将允许合成具有有效生物活性的完全加工分子不是显而易见的。然而，如果可以制备这种类似物，并且它们具有不同的杀昆虫活性谱，那么将非常期望它们，因为已知的spinosyns不能控制所有害虫。
发明简述在一个方面，本发明提供了一种能够在刺糖多孢菌中起作用而产生生物活性的spinosyn的杂化spinosyn聚酮合酶，所述合酶包含与多个刺糖多孢菌延伸模块可操作相连的异源装载模块。在优选实施方案中，用红霉素PKS或阿弗菌素PKS的装载模块取代spinosyn装载结构域。Ave和ery装载结构域尤其令人感兴趣，因为它们接受各种起始单位。也有效的是杂化PKS基因，其中异源装载模块整合罕见的起始单位，如雷帕霉素(环己烯羧酸)或myxathiazole(3-甲基丁酸)的装载模块。在培养基中可以提供所需的前体，如环己烯羧酸或3-甲基丁酸，或可以将编码它们的生物合成酶的基因引入到生物中，使得可以内源合成它们。
在另一个方面，本发明提供了能够在刺糖多孢菌中起作用而产生生物活性6-乙基spinosyn化合物、16-乙基spinosyn化合物、18-乙基spinosyn化合物或20-乙基spinosyn化合物的杂化spinosyn聚酮合酶，所述杂化聚酮合酶是由spinosyn生物合成DNA产生的产物，该DNA已经被修饰使得spinosyn PKS中模块8，3，2或1的AT结构域的DNA分别被正常整合入乙基丙二酰-CoA的AT结构域的DNA取代。在优选实施方案中，编码相关spinosyn AT结构域的DNA被编码泰洛星PKS的模块5或莫能星PKS的模块5的AT结构域的DNA取代。在优选实施方案中，肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)巴豆酰-CoA还原酶被共表达。
在另一个方面，本发明提供了能够在刺糖多孢菌中起作用而产生生物活性18-甲基spinosyn化合物或20-甲基spinosyn化合物的杂化spinosyn聚酮合酶，所述杂化聚酮合酶是由spinosyn生物合成DNA产生的产物，该DNA已经被修饰使得spinosyn PKS中模块2或1的AT结构域的DNA分别被正常整合甲基丙二酰-CoA的AT结构域的DNA取代。
在另一个方面，本发明提供了能够在刺糖多孢菌中起作用而产生生物活性16-脱甲基(desmethyl)spinosyn化合物的杂化spinosyn聚酮合酶，所述杂化聚酮合酶是由spinosyn生物合成DNA产生的产物，该DNA已经被修饰使得spinosyn PKS中模块3的AT结构域的DNA分别被正常整合丙二酰-CoA的AT结构域的DNA取代。在优选实施方案中，模块3的AT结构域被编码雷帕霉素PKS的模块2的AT结构域的DNA取代。
在另一个方面，本发明提供了制备6-乙基spinosyn化合物，21-脱乙基-21-正丙基spinosyn化合物，或6-乙基-21-脱乙基-21-丙基spinosyn化合物的方法，它包括培养巴豆酰-CoA还原酶与spinosyn生物合成途径共表达的转基因宿主生物。在优选实施方案中，用编码肉桂链霉菌的巴豆酰-CoA还原酶的DNA转化该宿主生物。
在另一个方面，本发明提供了已经用肉桂链霉菌巴豆酰-CoA还原酶的DNA转化的剌糖多孢菌菌株。
在另一个方面，本发明提供了编码如上所述本发明的杂化spinosyn聚酮合酶的DNA。
在另一个方面，本发明提供了包含如上所述DNA的载体。
在另一个方面，本发明提供了包含如上所述的DNA的宿主生物。
在另一个方面，本发明提供了通式(I)的化合物 其中R1是氢，甲基，或乙基；R2是氢，甲基，或乙基；R3是氢， 或
R4是甲基或乙基，二者任一可以被一个或多个选自卤素，羟基，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C1-C4烷硫基，或氰基的基团取代；R4是α-分支C3-C5烷基，C3-C8环烷基，或C3-C8环烯基，其中任何一个可以被一个或多个选自卤素，羟基，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C1-C4烷硫基，或氰基的基团取代；或R4是3-6员的杂环基，含有O或S，其为饱和或完全或部分不饱和，且可以被一个或多个选自卤素，羟基，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C1-C4烷硫基，或氰基的基团取代；R5是氢或甲基；R6是氢或甲基；R7是氢或甲基；R8是氢，甲基，或乙基；R9是氢，甲基，或乙基；或通式I化合物的5，6-二氢衍生物，前提是a)R4是被一个或多个选自卤素，羟基，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C1-C4烷硫基，或氰基的基团取代的甲基或乙基；或b)R4是α-分支C3-C5烷基，C3-C8环烷基，或C3-C8环烯基，其中任何一个可以被一个或多个选自卤素，羟基，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C1-C4烷硫基，或氰基的基团取代；或c)R4是3-6员的杂环基，含有O或S，其为饱和或完全或部分不饱和，且可以被一个或多个选自卤素，羟基，C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，C1-C4烷硫基，或氰基的基团取代；或d)R1或R2是乙基；或e)R8是甲基或乙基；或f)R9是甲基或乙基。
下列表3鉴定了本发明提供的示例化合物。以下引用的化合物编号是指表3中鉴定的化合物。
表3
通式I化合物的5，6-二氢衍生物(如表3中的化合物8)是通式II的化合物 其中R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，和R9如通式I所定义的。
在另一个方面，本发明提供了选自NRRL 30539，NRRL 30540，NRRL30541，和NRRL 30542的刺糖多孢菌的生物纯培养物。
在另一个方面，本发明提供了控制害虫的方法，它包括给害虫递送有效量的权利要求1的化合物。
在另一个方面，本发明提供了包含有效量权利要求1的化合物作为活性成分与适当稀释剂或载体组合的杀虫剂组合物。
附图简述


图1显示了pCJR81的构建。
图2显示了用于在刺糖多孢菌中基因表达的载体pLSB2和pLSB3的构建。
图3显示了将ery导入spinosyn途径的载体即pLSB62的构建。
图4显示了刺糖多孢菌13E的杂化ery/spn PKS途径。
图5显示了将ave导入spinosyn途径的载体即pLSB29的构建。
图6显示了刺糖多孢菌21K2的杂化ave/spn PKS途径。
图7a和7b显示了用于产生模块3AT交换质粒的中间质粒即pALK26的构建。
图8显示了用于将rapAT2导入spinosyn模块3的载体即pALK39的构建。
图9显示了用于在刺糖多孢菌中表达肉桂链霉菌巴豆酰-CoA还原酶基因的载体即pALK21的构建。
图10显示了用于将ty1AT5导入spinosyn模块3的载体即pALK36的构建。
图11显示了菌株刺糖多孢菌7D23的杂化PKS途径。
图12显示了菌株刺糖多孢菌36P4的杂化PKS途径。
序列简述SEQ ID NO1是寡核苷酸PRIS1。
SEQ ID NO2是寡核苷酸PRIS2。
SEQ ID NO3是普那霉素抗性的启动子的DNA序列。
SEQ ID NO4是寡核苷酸CR311。
SEQ ID NO5是寡核苷酸CR312。
SEQ ID NO6是寡核苷酸SP28。
SEQ ID NO7是寡核苷酸SP29。
SEQ ID NO8是用于克隆的编码ery PKS装载模块的DNA片段，在bp1-6和bp1680-1685导入了限制性酶切位点。
SEQ ID NO9是寡核苷酸SP14。
SEQ ID NO10是寡核苷酸SP15。
SEQ ID NO11是用于克隆的编码ave PKS装载模块的DNA片段，在bp1-6和bp1689-1694导入了限制性酶切位点。
SEQ ID NO12是寡核苷酸CR322。
SEQ ID NO13是寡核苷酸CR323。
SEQ ID NO14是寡核苷酸CR324。
SEQ ID NO15是寡核苷酸CR325。
SEQ ID NO16是寡核苷酸CR328。
SEQ ID NO17是寡核苷酸CR329。
SEQ ID NO18是寡核苷酸CR330。
SEQ ID NO19是寡核苷酸CR321。
SEQ ID NO20是用于克隆的编码rap AT2的DNA片段，在bp1-6和bp832-837导入了限制性酶切位点。
SEQ ID NO21是寡核苷酸CCRMONF。
SEQ ID NO22是寡核苷酸CCRMONR。
SEQ ID NO23是用于表达肉桂链霉菌巴豆酰-CoA还原酶的DNA序列，在bp1-6和bp1389-1394导入限制性酶切位点。
SEQ ID NO 24是寡核苷酸AK1。
SEQ ID NO 25是寡核苷酸AK2。
SEQ ID NO 26是用于克隆的编码ty1 AT5的DNA片段，在bp1-6和bp967-972导入了限制性酶切位点。
发明详述培养物说明下表中鉴定了来源于刺糖多孢菌NRRL18537或刺糖多孢菌NRRL18538并产生本发明化合物的新菌株。该培养物已经根据布达佩斯条约在Midwest Area Regional Center，Agricultural Research Service，United States Department of Agriculture，815 North UniversityStreet，Peoria，IL 61604保藏。该菌株保藏于2001年1月15日，分配的保藏号如下表4详述。
表4
培养特性来源于刺糖多孢菌NRRL 18537或刺糖多孢菌NRRL 18538并产生本发明化合物的新菌株具有下列培养特性所有培养物在ISP2和Bennett′s琼脂上生长良好，在使用的所有培养基中产生气生菌丝。气生孢子团以白色占优势(随年龄发展为浅粉色)。基底菌丝体为奶油色至浅褐色，没有明显的区别性颜色。可溶的褐色色素释放到培养基中。在使用的任何培养基中没有观察到显著差异。
Spinosyn途径和附属基因的操作为了促进spinosyn生物合成途径的操作，获得了粘粒pRHB9A6和pRHB3E11，所述粘粒在美国专利6,274,350 B1和Waldron等(2001)中描述。
从spinosyn生物合成基因的序列不能直接明显知道spinosyns的产生是如何调节的。为了避免与基因簇调节相关的潜在复杂情况，使用很多异源启动子来驱动全部或部分聚酮合酶部分(基因spnA，spnB，spnC，spnD和spnE)。发现下列启动子至少在制备spinosyn PKS中与天然启动子同样有效(由终产物spinosyn A，spinosyn D，spinosyn A C17-假糖苷配基和spinosyn D C17-假糖苷配基的产生判断)来自S.coelicolor的放线菌紫素生物合成簇的actI启动子，与其相关活化剂actII-ORF4一起使用(如WO98/01546，WO98/01571，Rowe等1998所述)；和普那霉素抗性的启动子。以前报道了后者驱动S.erytharae的聚酮基因的过度表达(Blanc等1995；Sala-Bey等1995)。它是链霉菌物种中可由生理应力诱导的启动子。刺糖多孢菌中异源启动子的使用不限于上述的那些，并且可包括预期在刺糖多孢菌中起作用的其它启动子。
使用异源装载模块的杂化spinosyn PKS在一个方面，本发明提供了在刺糖多孢菌中起作用而产生被加工成生物活性spinosyns的聚酮化合物的杂化PKSs。所得聚酮化合物延伸至与天然spinosyns相同的长度，并通过交联和糖基化加工产生新的杀昆虫剂spinosyns。优选的杂化PKS包含来自spn PKS的延伸模块以及异源装载模块，可产生具有不同起始单位的spinosyn聚酮化合物。在异源装载模块之后含有spn延伸模块的杂化spinosyn PKS基因可提供在C21具有不同侧链的新spinosyns。这个侧链的性质由被装载模块选择以启动聚酮化合物合成的起始单位决定。侧链中的改变可能改变所得spinosyn的物理特性或生物活性。尤其有用的是提供这样一种杂化PKS基因，其中装载模块接受很多不同的羧酸，包括非天然的酸。通过不同起始单位的整合，这种基因可以用于产生很多不同的spinosyns。例如，spn PKS的装载模块可被已知接受多种起始单位(Dutton等，1991)的ave PKS的装载模块取代。也已知ery PKS的装载模块也可以接受不同的起始单位(Pecey等，1998)。因此，表达这种杂化spinosyn PKS基因的生物可产生新的spinosyns，其中在C21的侧链的性质由饲喂该生物的羧酸决定。该侧链可以是不同长度，带有支链或环，和/或含有杂原子。
更优选地，该杂化PKS包括接受很多不同羧酸的装载模块，因此该杂化基因装配体可以用于产生很多不同的spinosyns。特别有效的实例含有spn延伸模块，以及来自红霉素(ery)PKS的装载模块或来自阿弗菌素(ave)PKS的装载模块。
使用ery装载模块的杂化spinosyn PKS红霉素生物合成簇(eryATOACP0)的装载模块管理丙酰-CoA导入红霉素分子的起始物。以前已经表明通过将游离酸补入制备培养基，不同的起始物可以并入红霉素分子(Pacey等1998)。
如下列实施例所示，红霉素装载模块取代spinosyn装载模块的杂化spnA基因的产生导致可接受游离酸进入起始单位的spinosyn PKS。在下列示例性实施例中，红霉素装载模块就在保守区中KS结构域内与spinosyn KS1起始处拼接。优选在结构域内或接近其边缘处于保守DNA序列中产生新的结构域或模块连接；然而，通过在结构域之间的区域改造拼接部位可替换性地产生活性聚酮合酶(WO 98/01546)。
ery装载片段按照读码框克隆到spnA区域和其上游以允许与天然spn PKS的同源重组。ery装载片段的上游是actI启动子(PactI)或普那霉素抗性的启动子(Pptr)，分别产生质粒pLSB61和pLSB62。这些质粒基于pKC1132，因此是安普霉素抗性的。它们也携带用于DNA接合转移到放线菌的oriT(Bierman等1992，Matsushima等1994)。这些构建体通过接合转化入刺糖多孢菌NRRL 18537。PCR扩增证实接合后体在适当启动子下含有杂化ery/spn PKS。
刺糖多孢菌NRRL 18537pLSB62称作刺糖多孢菌13E，并用于spinosyn制备的分析。
如下列实施例证明，当在制备培养基中培养时，刺糖多孢菌13E主要产生大约等量的spinosyn A和spinosyn E。Spinosyns的总产量估计大约是野生型spinosyn A水平的10-25％，这代表了spinosyn E产量大约增加10倍。这个产物比例的改变可能是ery装载模块相对于spn装载模块具有更宽松的特异性的反映，或刺糖多孢菌与红色糖多孢菌相比不同底物供应的反映，或二者的组合。当红霉素途径上调时，在红色糖多孢菌中观察到ery装载模块醋酸盐的整合(Rowe等1998)。菌株13E中spinosyn E产量增加超过野生型水平意味着这将是制备spinosyn E的优选菌株。
很多羧酸补入刺糖多孢菌13E，导致起始单位改变的新spinosyn类似物的产生。新spinosyns中鉴定的是21-脱乙基-21-环丙基spinosyns A和D(通过整合入环丙烷羧酸)，21-脱乙基-21-环丁基spinosyns A和D(通过整合入环丁烷羧酸)和21-脱乙基-21-甲基硫代甲基spinosyns A和D(来自甲基硫代乙酸)。新的类似物显示合理的层析截留时间，特征性UV发色团和MS片段化模式，准确的质量测定支持预测的结构。全NMR表征证实分离的21-环丙基和21-环丁基化合物的结构分配。分离的化合物在昆虫控制试验中有活性。
刺糖多孢菌13E菌株的用途不限于制备这些化合物。预期通过补入其它酸可以鉴定很多其它spinosyn类似物，如用于制备新的红霉素的那些酸(Pacey等1998)。
实施例1 pCJR81的构建见
图1.质粒pCJR81是表达普那霉素抗性的启动子之下的聚酮化合物基因的载体。它构建如下设计两个重叠寡核苷酸执行PCR反应，其中它们起引物和模板的作用。它们导入有整合了ATG起始密码子的NdeI限制性位点，使得可以以与核糖体结合位点最佳距离克隆基因。整合了SpeI限制性位点以促进进一步克隆。寡核苷酸是PRIS1(SEQ ID NO1)和PRIS2(SEQ IDNO2)。
使用制造商的条件用Pwo耐热DNA聚合酶执行扩增以获得启动子片段。用T4多核苷酸激酶磷酸化112bp片段，并克隆入用SmaI消化和去磷酸化的商业上可获得的pUC18。测序含插入物的质粒。一个含有正确序列的质粒记做pRIS4。
来自pRIS4的94bp插入物被切除作为SpeI/NdeI片段(SEQ ID NO3)并克隆进入先用SpeI和NdeI消化的pCJR24(WO 98/01546，WO98/01571，Rowe等1998)。一个正确的质粒记做pCJR81。
实施例2 用于来自刺糖多孢菌表达的质粒的构建见图2。构建质粒pLSB2和pLSB3以进行聚酮化合物基因或附属基因在刺糖多孢菌中的表达。质粒pLSB2含有actI启动子(PaCtI)及其相关活化剂即actII-ORF4。质粒pLSB3含有普那霉素抗性的启动子(Pptr)。这些质粒构建如下质粒pKC1132(Bieman等1992)含有转移起点(oriT)，和用于在大肠杆菌和放线菌中选择的安普霉素抗性标记。因此它可以用于大肠杆菌中DNA操作，并允许最终质粒通过接合导入刺糖多孢菌。为了提供适当的EcoRV/SpeI/NdeI/XbaI限制性位点，用两个寡核苷酸CR311(SEQ IDNO4)和CR312(SEQ ID NO5)的接头取代pKC 1132的多接头(polylinker)。
用PvuII消化质粒pKC 1132并用虾碱性磷酸酶将末端去磷酸化。用T4多核苷酸激酶磷酸化寡核苷酸CR311和CR312，退火并克隆进入pKC1132_PvuII而产生pLSB1。从pCJR24分离含有放线菌紫素途径特异性活化剂即actII-ORF4和actI启动子的SpeI/NdeI片段(WO98/01546，WO 98/01571，Rowe等1998)和从pCJR81分离含有普那霉素抗性的启动子的SpeI/NdeI片段(上述，实施例1)。这些片段的每一个都分别克隆进入用SpeI和NdeI消化的pLSB1而产生pLSB2(含有actII-ORF4和PactI)和pLSB3(含有Pptr)。
实施例3 将红霉素聚酮合酶的装载模块整合入spinosyn聚酮合酶的载体的构建见图3。将红霉素聚酮合酶的装载模块整合入spinosyn聚酮合酶的载体含有红霉素装载模块(AT0ACP0)，随后是提供整合同源性的spinosyn PKS的第一个模块的区域。这个载体记做pLSB62，并构建如下。
使用pCJR26作为模板，以及寡核苷酸SP28(SEQ ID NO6)和SP29(SEQ ID NO7)通过PCR扩增红霉素装载模块(Rowe等1998)。SP28在ery序列的起始密码子处整合了NdeI位点，SP29在KS1结构域起始处整合了NheI位点。
PCR片段被磷酸化，凝胶纯化并克隆进入先用SmaI消化和去磷酸化的pUC18。筛选具有插入物的克隆并测序。一个含有正确序列的克隆记做pLSB44。它含有NheI位点接近多接头的EcoRI位点方向的插入物。从NdeI位点到Ndel位点的所用的红霉素装载模块片段序列如SEQ ID NO8所示。
质粒pLSB8(实施例11中描述)含有在spnKS1的NheI位点开始的spnA片段。从pLSB44切除含有红霉素装载模块的片段作为NdeI/Nhe I片段并克隆进入先用NdeI和NheI消化的pLSB8，得到pLSB56。pLSB56中含有的片段含有按读码框与spinosyn KS1拼接的红霉素装载模块，并且具有足以发生整合的与spnA同源的区域。
除去这个区域作为NdeI/XbaI片段并克隆进入pLSB3得到pLSB62。这使新的ery/spn杂化片段在载体中置于Pptr之下，该载体可以通过接合转移到刺糖多孢菌并使用安普霉素抗性标记进行选择。
实施例4 含有包含与spinosyn PKS的KS1融合的红霉素装载模块的杂化聚酮合酶的刺糖多孢菌菌株的产生见图4。通过大肠杆菌S17-1(Simon等，1983)的接合(Matsushima等1994)用pLSB62转化刺糖多孢菌NRRL 18537。选择转化体的抗安普霉素抗性并用PCR筛选。单一转化体记做菌株刺糖多孢菌13E。
实施例5 刺糖多孢菌发酵的化学分析下列HPLC方法可有效分析制备天然spinosyns和新的非天然的工程改造的spinosyns的发酵。
在2ml Eppendorf管中，通过添加20％氨溶液(ca.20μl)将发酵肉汤培养基等分部分(1mL)调节到pH～10。乙基醋酸酯(1mL)添加到样品中并使用旋涡混合器有力混合60秒。在microfuge中离心分离混合物并将上相移取到清洁的2ml Eppendorf管。使用Speed-vac蒸发除去乙基醋酸酯。残留物溶于甲醇(250ul)并使用microfuge澄清。用下列HPLC系统分析灌注体积50μl柱固定相150×4.6mm柱，碱灭活硅胶3μm(Hypersil C18-BDS)。
流动相A10％乙腈90％水，含10mM醋酸铵和0.15％甲酸。
流动相B90％乙腈10％水，含10mM醋酸铵和0.15％甲酸。
流动相梯度T＝0分钟，10％B；T＝1，10％B；T＝25，95％B；T＝29，95％B；T＝29.5，10％B。
流速1mL/分。
检测在254nm UV；超过m/z范围100-1000的MS。
实施例6 刺糖多孢菌13E发酵产生的代谢产物用冰冻营养原液(1∶1CSM培养物∶冷冻防腐剂，其中冷冻防腐剂是溶于水的10％乳糖，20％甘油w/v)培养刺糖多孢菌13E。初级预培养物生长于CSM培养基(胰蛋白酶大豆肉汤培养基30g/l，酵母提取物3g/l，硫酸镁2g/l，葡萄糖5g/l，麦芽糖4g/l；Hosted和Baltz1996；美国专利5,362,634)，共50mL培养物，250mL带钢弹簧的Erlenmeyer瓶中，在30℃，75％相对湿度下，250rpm下两英寸来回振荡三天。这用于在营养培养基(葡萄糖10g/l，N-Z-胺A 30g/l，酵母提取物3g/l，硫酸镁2g/l；Strobel和Nakatsukasa 1993；美国专利5,362,634)中以5％v/v接种次级预培养物，其在相同条件下培养另外2天。次级营养预培养物用于以5％v/v接种制备培养基(葡萄糖67g/l，Proflo棉籽粉25g/l，胨化牛奶营养物22g/l，玉米浸泡液12g/l，甲基油酸酯40g/l，碳酸钙5g/l，用氢氧化钠使pH调至7.0；Strobel和Nakatsukasa 1993)。在与预培养相同的条件下发酵小规模制备培养物，但是进行7-10天。对于初始刺糖多孢菌13E生产，小规模培养物在250ml带钢弹簧的Erlenmeyer瓶的30ml制备培养基中生长7天。
对于产生的代谢产物的鉴定，如实施例5所述用LC-MS分析1ml等分部分发酵肉汤培养基。通过与可信标准，以及与来自未转化的菌株刺糖多孢菌NRRL 18537的发酵提取物比较，由刺糖多孢菌13E产生的主要化合物鉴定为spinosyns A和E(产生的量大约相等)和spinosyn D(观察到少量产物)。刺糖多孢菌13E菌株的滴定度是～10-15mg/l的总spinosyns。刺糖多孢菌13E的产物比例不同于NRRL18537，其spinosynE的相对产量明显增加。
实施例7 前体指导的从刺糖多孢菌13E产生新spinosyns(化合物1-6的制备)ery/spn杂化PKS用于产生新的spinosyn代谢产物，其中将羧酸补入制备培养基。ery装载模块将羧酸整合入分子的起始物中。
平行制备瓶(30mL，在带有弹簧的250mL Erlenmeyer瓶中)如实施例6所述进行接种。24h后，这些中每一个补入羧酸(溶于水形成的原液和用氢氧化钠将pH调节到6.5)，终浓度2-6mM。7天后，如实施例5所述用LC-MS分析1ml等分部分发酵肉汤培养基。UV和MS层析谱中新峰的出现表明环丁基羧酸、环丙基羧酸和甲基硫代乙酸的整合产生了新的C21修饰的spinosyns(表5)。新化合物的MS谱提供[M+H]+离子和福洛氨糖(forosamine)片段离子。
表5
实施例8 21-脱乙基-21-环丁基spinosyns A和D(化合物3和4)的制备和分离将刺糖多孢菌13E的冰冻营养原液接种到CSM(50ml，在带弹簧的250mL Erlenmeyer瓶中)的初级营养预培养物中。如实施例6所述制备和孵育在营养培养基(250ml，在带弹簧的2L Erlenmeyer瓶中)中的次级预培养物，但是在300rpm下，一英寸来回振荡。
如实施例6，制备十二至14L制备培养基，添加0.01％v/v PluronicL-0101(BASF)防泡剂。用次级营养预培养物以5％v/v接种制备培养基，并允许在20L搅拌的生物反应器中30℃发酵7-10天。气流设置在0.75vvm，超压设置在0.5barg或之下，为了保持溶解氧压力处于或高于30％空气饱和度，叶轮尖(impeller tip)速度控制在0.39和1.57ms-1之间。如果需要，添加另外的Pluronic L0101(BASF)控制发泡。在25小时，向生物反应器中添加环丁基羧酸，至终浓度5mM。7天后收集发酵肉汤培养基并离心使澄清，从而提供上清和细胞。与等体积甲醇充分混合来提取细胞(1L)，接着允许静置30分钟。离心细胞-甲醇浆液，倾倒出上清。重复该步骤。添加5N NaOH调节发酵上清(12L)至pH～10，在0.75体积的乙基醋酸酯下轻轻搅拌8小时。吸出除去上相并重复提取。乙基醋酸酯和乙醇馏分混合并真空除去溶剂，产生黄色-棕色油/水混合物(1L)。这与乙基醋酸酯(2L)混合并用50mM酒石酸(3×1.5L)溶液提取。混合酒石酸提取物，用5N NaOH调节pH～10，并用乙基醋酸酯(3×1.5L)溶液提取。混合乙基醋酸酯提取物并真空除去溶剂，留下棕色含油残留物(7.5g)。残留物溶于乙基醋酸酯(500mL)并用50mM酒石酸(350mL)提取三次。混合酒石酸馏分，调节至pH～10并用乙基醋酸酯(3×500mL)再次提取。混合乙基醋酸酯馏分并真空除去溶剂产生棕色含油残留物(0.5g)。
含油残留物溶于甲醇(1.5ml)并以两等份进行层析，即通过碱灭活的反相硅胶(Hypersil C18-BDS，5μm；21×250mm)，以20ml/分的流速用如下述流动相梯度洗脱。
流动相梯度T＝0分钟，15％B；T＝5，35％B；T＝35，90％B；T＝45，95％B。
流动相A10％乙腈/90％水，含10mM醋酸铵和0.15％甲酸。
流动相B90％乙腈/10％水，含10mM醋酸铵和0.15％甲酸。
每隔30秒收集馏分。混合来自最初分馏的含21-脱乙基-21-环丁基spinosyn A的馏分，真空除去溶剂。残留物通过反向硅胶(ProdigyC18，5μm；10×250mm)进行层析，以5ml/分的流速用如下述梯度洗脱。
T＝0，55％ B；T＝5，70％ B；T＝35，95％ B；T＝45，95％B。
每隔30秒收集馏分。混合含21-脱乙基-21-环丁基spinosyn A的馏分，真空除去乙腈，并使用C18-BondElute筒(200mg)浓缩样品。在重力下施加该样品，用水(10mL)洗涤并用甲醇(2×10mL)洗脱，接着真空除去溶剂。混合最初粗分馏的含有21-脱乙基-21-环丁基spinosyn D的馏分并真空除去溶剂。残留物通过反向硅胶(Prodigy C18，5μm；10×250mm)进行层析，以5ml/分的流速用如下述梯度洗脱。
T＝0分钟，25％B；T＝5，55％B；T＝35，95％B；T＝45，95％B。
每隔30秒收集馏分。混合含21-脱乙基-21-环丁基spinosyn D的馏分，真空除去乙腈，并使用C18-BondElute筒(200mg容量)浓缩样品。在重力下施加该样品，用水(10mL)洗涤并用甲醇(2×10mL)洗脱，接着真空除去溶剂。
通过分光镜方法，包括核磁共振光谱(NMR)，质谱分析法(MS)、紫外线光谱法(UV)、偶联高效液相色谱-质谱分析(HPLC-MS)，和与已知化合物spinosyns A，D，E和F的光谱数据进行比较，确定新的spinosyns的化学结构。
21-脱乙基-21-环丁基spinosyn A(化合物3)具有下列特征分离产量3.1mg分子量757分子式C43H67NO10UV(HPLC-MS分析过程中通过二极管阵列检测)245nm电喷MS[M+H]+的m/z＝758.5；福洛氨糖(forosamine)片段离子在m/z＝142.2。
准确FT-ICR-MS[M+H]+的m/z＝758.4830(需要758.4838)。
表6显示了21-脱乙基-21-环丁基spinosyn A在CDCl3中的1H和13CNMR化学迁移数据。
表6
化学迁移参照CHCl3在7.26ppm的质子。
21-脱乙基-21-环丁基spinosyn D(化合物4)具有下列特征分离产量～1mg分子量771分子式C44H69NO10UV(HPLC-MS分析过程中通过二极管阵列检测)245nm电喷MS[M+H]+的m/z＝772.5；福洛氨糖(forosamine)片段离子在m/z＝142.2。
材料量少妨碍对这个分子的详细NMR研究，但是所累积的数据与预期结构一致。通过与21-脱乙基-21-环丁基spinosyn A的数据比较来辅助这一分析。
实施例9 5，6-二氢-21-脱乙基-21-环丁基spinosyn A(化合物8)和5，6-二氢-21-脱乙基-21-正丙基spinosyn A(化合物29)的制备2mL甲苯和0.5ml乙醇中的21-脱乙基-21-环丁基spinosyn A(3.1mg，0.004mmol)用缓慢的氮流喷20分钟，接着添加2mg氯化三(三苯基膦)铑，在60℃和1atm下氢化溶液16小时。冷却和除去溶剂后，使用10cm×2cm硅胶柱层析残留物，分别用含0％，2％，3％，4％，和5％的MeOH的5×25mL二氯甲烷洗脱。混合含产物的馏分并浓缩得到2.1mg 5，6-二氢-21-脱乙基-21-环丁基spinosyn A.MS M+760。
使用相同步骤从21-脱乙基-21-正丙基spinosyn A(化合物23)制备5，6-二氢-21-脱乙基-21-正丙基spinosyn A(化合物29)。
实施例10 21-脱乙基-21-环丙基spinosyns A和D(化合物1和2)的制备和分离将刺糖多孢菌13E的冰冻营养原液接种到CSM(50ml，接种在带弹簧的250mL Erlenmeyer瓶)中的初级营养预培养物中。如实施例8所述制备和孵育在营养培养基(250ml，在带弹簧的2L Erlenmeyer瓶中培养)中的次级预培养物。
如实施例6，制备十四升制备培养基，添加0.01％v/v PluronicL-0101(BASF)防泡剂。用次级预培养物以5％v/v接种制备培养基，并允许在20L搅拌的生物反应器中在实施例8所述条件下发酵7-10天。在45小时，环丙基羧酸补入生物反应器中，至终浓度5mM。7天后收集发酵肉汤培养基并如实施例8所述提取。
含油残留物溶于甲醇(1.5ml)并如实施例8所述进行初次粗层析。混合含有21-脱乙基-21-环丙基spinosyn A的最初分离物的馏分并真空除去溶剂。残留物通过反相硅胶(Prodigy C18，5μM；10×250mm)进行层析，以5ml/分的流速用如下述梯度洗脱。
T＝0分钟，55％B；T＝70％B；T＝30，95％B；T＝35，95％B。
每隔30秒收集馏分。混合含21-脱乙基-21-环丙基spinosyn A的馏分，真空除去乙腈，并使用C18-BondElute筒(200mg)浓缩样品。在重力下施加该样品，用水(10mL)洗涤并用甲醇(2×10mL)洗脱，接着真空除去溶剂。
21-脱乙基-21-环丙基spinosyn A(化合物1)具有下列特征分离产量～1mg分子量743分子式C42H65NO10UV(HPLC-MS分析过程中通过二极管阵列检测)245nm电喷MS[M+H]+的m/z＝744.5；福洛氨糖(forosamino)片段离子在m/z=142.2。
表7总结了21-脱乙基-21-环丙基spinosyn A在CDCl3中的1H和13CNMR光谱数据。
表7
化学迁移参照CHCl3在7.26ppm的质子。
*这些标记(assignment)可互换。
21-脱乙基-21-环丙基spinosyn D(化合物2)具有下列特征分离产量～0.5mg分子量757分子式C43H67NO10UV(HPLC-MS分析过程中通过二极管阵列检测)245nm电喷MS[M+H]+的m/z＝758.5；福洛氨糖(forosamine)片段离子在m/z＝142.2。
材料量少妨碍对这个分子的详细NMR研究，但是所累积的数据与预期结构一致。通过与21-脱乙基-21-环丙基spinosyn A的数据比较来辅助这一分析。
b.使用ave装载模块的杂化spinosyn PKS阿弗菌素生物合成簇的装载模块(aveAT0ACP0)管理C-2分支的起始单位导入阿弗菌素分子，其中该分子得自异丁酰-CoA和2-甲基丁酰-CoA。存在将这个装载结构域交换入红霉素PKS途径得到具有阿弗菌素系统起始单位特异性的新聚酮化合物的先例(WO 98/01546，WO98/01571，Marsden等1998)。也已经表明阿弗菌素装载模块整合了来自制备培养基的广泛游离酸的CoA-酯，在其天然环境中，或作为ave/ery杂化途径的一部分(Pacey等1998)。文献中描述的阿弗菌素装载模块交换实际是阿弗菌素AT0ACP0取代红霉素AT0ACP0。这产生起始密码子和SpeI位点之间阿弗菌素AT0上游的一段红霉素DNA序列。这包括在ave/ery实验中，因为N末端区域(同源AT结构域上游)在红霉素装载模块中比在阿弗菌素中大得多，而且对该蛋白的稳定性可能很重要。因为所得杂化体具有产出性，相同区域用于ave/spn杂化体。实际上，所得杂化基因是ery/ave/spn杂化体，但是由于它将阿弗菌素装载模块的特异性转移给spinosyn PKS，因此它记做ave/spn杂化体。
在spnKS1框内和上游，PactI或Pptr控制下，从pIG1(WO 98/01546，WO98/01571，Marsden等1998)克隆阿弗菌素装载模块(AT0ACP0)。KS1同源区域的起始边缘处的相同拼接位点用作上述的ery装载模块实验。合并来自pRHB3E11的用于整合的同源区域。所得质粒pLSB29(杂化PKS区域在PactI控制之下)和pLSB30(杂化PKS区域在Pptr控制之下)基于pKC1132，因此含有在大肠杆菌和刺糖多孢菌中筛选的安普霉素抗性标记，以及用于从大肠杆菌到刺糖多孢菌的DNA接合转移的oriT(Bierman等1992，Matsushima等1994)。这些构建体通过接合转化到刺糖多孢菌NRRL 18538中。用PCR分析证实接合后体在适当启动子下含有杂化ave/spn PKS基因。
刺糖多孢菌NRRL 18538pLSB29记做刺糖多孢菌21K2。它通过将醋酸和丙酸并入装载模块而主要产生spinosyns E，A和D。在LC-MS中观察到另外的小峰，质量与新的天然产物21-脱乙基-21-异丙基spinosyn A和21-脱乙基-21-仲丁基spinosyn A和等价D类似物一致。这些少量产物是由异丁酸和2-甲基丁酸分别并入起始单位得到的。在阿弗菌素生物合成本身中，ave装载模块仅招募这些支链起始单位。然而，当ave装载模块拼接至红霉素PKS中的KS1上游时，观察到较宽的产物谱，表明这种杂化体可合并醋酸和丙酸。因此我们观察到来自这个工程改造的刺糖多孢菌菌株的期望范围的产物。
NMR表征证实了分离的21-脱乙基-21-异丙基spinosyn A的结构。21-脱乙基-21-正丙基spinosyn A作为少量成分分离自21-脱乙基-21-异丙基spinosyn A的制备培养物。21-正丙基类似物，推测是由装载模块从培养基中整合丁酸而制备的，也被完全表征。二者在昆虫控制试验中都有效。
以前已经将阿弗菌素PKS的装载模块的一些天然多能性转移到红霉素系统中，因此给刺糖多孢菌21K2补入广泛的游离酸以产生具有改变起始单位的spinosyns。基于UV发色团、质量和质谱馏分，连同补入哪一种酸和由此预期每个实验的哪一种化合物的知识鉴定了新的spinosyn化合物。为了证实所作的结构预测，分离具有新C21起始基团的很多spinosyn类似物并充分描述其特征。
可以这样使用的游离酸包括但不限于下列环状有机酸，包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基和2-甲基环丙基；含杂原子的环状有机酸，包括2-糠酸、3-糠酸、噻吩羧酸和甲基噻吩羧酸；支链羧酸；和一些其它酸，包括甲基硫代乙酸、氯乙酸、氰基乙酸和甲氧基乙酸。
这种补料实验产生spinosyns类似物(spinosyn是表1和2和通式I例举的类型的具有22员四环核心的大环内酯)，其中C21带有非乙基的侧链，通常是α-分支C2-C5烷基，C3-C8环烷基或环烯基(任选用如一个或多个羟基，C1-4烷基或烷氧基或卤原子取代)，或3-6员的含有O或S的杂环，饱和或完全或部分不饱和，任选取代(如取代环烷基)。优选的C21取代基候选物是可用作ery或ave装载模块的底物的羧化物单位的基团。优选的底物包括环丁烷羧酸和环丙烷羧酸。其它可能性包括正丁酸、异丙基羧酸、2-(S)-甲基丁酸、2-甲基环丙烷羧酸、3-糠酸和甲基硫代乙酸。
由于ave装载模块的正常特异性，补入支链酸异丙基和2-甲基丙基羧酸不改变新的天然产物的产量。在刺糖多孢菌21K2的所有健康培养物中观察到低产量的这些产物。
ave装载模块接受环丙基羧酸得到A和D类似物，和显著比例的A类似物的C17假糖苷配基。观察到的环丁基产物水平比杂化ery/spn系统中的高，其中21-脱乙基-21-环丁基spinosyn A为～5-10mg/升，21-脱乙基-21-环丁基spinosyn D的水平较低一点，但也是显著的，21-脱乙基-21-环丁基spinosyn A 17-假糖苷配基为～10-15mg/升。环丙基羧酸补料也是成功的，产生21-脱乙基-21-环丙基spinosyns A和D。这两个环丁基类似物和环丙基A类似物显示出与从ery装载模块实验分离的纯化化合物等同。
并入甲基硫代羧酸得到21-脱乙基-21-甲基硫代甲基spinosyn A，产量可以与上面环丁基实验相当。相对于用ery装载模块实验生产相同化合物而言，这在产量方面是一个显著的改进。也并入2-糠酸和甲基环丙基羧酸得到预期的新产物。
实施例11 阿弗菌素聚酮合酶的装载模块并入spinosyn聚酮合酶的载体的构建见图5。阿弗菌素聚酮合酶的装载模块并入spinosyn聚酮合酶的载体含有阿弗菌素装载模块(AT0ACP0)，后面是spinosyn PKS的第一模块区域以提供整合的同源性。该载体记做pLSB29并构建如下以前阿弗菌素装载模块已经被拼接至红霉素模块1的上游(WO98/01546，WO 98/01571，Marsden等1998)。在这个ave/ery杂化体中，装载模块在开始处具有编码ery氨基酸序列的DNA，后面是ave PKS的AT0ACP0。这个杂化片段提供了阿弗菌素装载模块的特异性，尽管它包括少量ery序列。相同片段用于这个实验，并产生ery/ave/spn杂化蛋白。我们仅仅将它描述为ave/spn杂化体，因为在spinosyn途径中提供的是阿弗菌素装载模块的特异性。该片段以含有起始密码子的NdeI位点开始，并以KS1开始处的NheI位点结束。这将会使保守氨基酸改变(Ile-Leu)导入spinosyn KS1序列。
为了导入NheI位点，使用pRHB3E11(US 6,274,350 B1，Waldron等2001)作为模板，以及寡核苷酸SP14(SEQ ID NO9)和SP15(SEQID NO10)通过PCR扩增来自KS1起始处的SpnA区域。SP14在碱基24107-24112(编号参照US 6,274,350的SEQ ID NO1)处引入NheI位点。SP15结合下游大约1500bp的BstEII位点(25646-25652)。NotI位点也并入SP15用于随后克隆步骤。使用Pwo耐热聚合酶在标准条件下实施PCR。
PCR产物被磷酸化，凝胶纯化并克隆进入先用SmaI消化和去磷酸化的pUC19。对很多含插入物的克隆测序。在载体中以NheI位点邻接EcoRI位点的方式含有插入物的一个克隆记做pLSB5。
为了提供大量足够用于整合的同源性区域，从pRHB3E11克隆大约2.6kbp的片段(从BstEII至NotI)进入pLSB5，产生pLSB8。
接着从pIG1(WO 98/01546，WO 98/01571，Marsden等1998)克隆阿弗菌素装载模块作为NdeI/NheI片段并连接到先用NdeI和NheI消化的pLSB8。使用的阿弗菌素装载模块片段的DNA序列，从NdeI位点至NheI位点，示于SEQ ID NO 11。所得质粒记做pLSB14。
pLSB14中所含片段含有与spinosyn KS1按读码框拼接的阿弗菌素装载模块，还具有足以用于发生整合的与spnA同源的区域。
接着移出这个片段作为NdeI/XbaI片段并克隆进入pLSB2得到pLSB29。这将新的ave/spn杂化片段在载体中置于PactI之下，该载体可通过接合转移进入刺糖多孢菌并接着使用安普霉素抗性标记进行选择。
实施例12 含杂化聚酮合酶的刺糖多孢菌菌株的产生，该合酶包含与spinosyn PKS的KS1融合的阿弗菌素装载模块见图6。通过大肠杆菌S17-1(Simon等，1983)的接合(Matsushima等，1994)用pLSB29转化剌糖多孢菌NRRL18538。用安普霉素抗性选择转化体并用Southern印迹分析来筛选。显示正确杂交模式的单一转化体表明该质粒已通过同源重组整合进入染色体，并记做刺糖多孢菌菌株21K2。
实施例13 通过刺糖多孢菌21K2发酵制备代谢产物(化合物9-12的生产)冰冻营养原液培养的刺糖多胞菌21K2用于接种CMS培养基(Hosted和Baltz 1996；US 5,362,634)。这个预培养物生长在以300rpm，一英寸来回振荡的瓶中，温度30℃进行3天。这用于以5％v/v接种营养培养基(Strobel和Nakatsukasa 1993；美国专利5,362,634)并在相同条件下培养另外2天。该营养培养基(Strobel和Nakatsukasa1993)用于以5％v/v接种制备培养基。小规模制备培养物在与预培养物相同的条件下发酵，但是进行7-10天，以250rpm，两英寸来回振荡和以75％相对湿度。最初小规模制备培养物在6mL制备培养基中在25mL带有弹簧的Erlenmeyer瓶中生长7天。
为了鉴定产生的代谢产物，如实施例5所述用LC-MS分析1ml等分部分发酵肉汤培养基。通过与可信标准，以及与来自菌株刺糖多孢菌NRRL 18538的发酵提取物比较，由刺糖多孢菌21K2产生的主要化合物是spinosyns A，D和E。spinosyn A是产生的主要成分，且spinosyn总产量是～50mg/L。
除了已知的spinosyns A，D和E，清晰存在四个新的化合物。这些新化合物的层析截留时间和质谱数据(表8)与它们通过整合支链起始单位(异丙基羧酸和2-甲基丁酸)的合成一致。新化合物的MS谱给出了[M+H]+种和福洛氨糖片段的离子(142.3)。补入异丙基羧酸得到的化合物以比补入2-甲基丁酸得到的那些高2-3倍的水平存在。新化合物占存在的总spinosyns的至多5％。
表8
实施例14前体指导的由刺糖多孢菌21K2产生的新spinosyns(化合物1-6和13-20的产生)通过向制备培养基中补入羧酸，ave/spn杂化PKS用于产生新的spinosyn代谢产物。阿弗菌素装载模块将羧酸整合入该分子的起始物中。
如实施例13所述接种平行6ml制备瓶。24小时后，这些中的每一个补入羧酸(溶于水的原液并用氢氧化钠调节pH至6.5)，终浓度3mM。7天后，如实施例6和12所述用LC-MS分析1ml等分部分的发酵肉汤培养基。环丁基羧酸、环丙基羧酸、2-甲基环丙基羧酸、甲基硫代乙酸和3-糠酸的并入提供了新的C21修饰的spinosyns，如UV和MS层析中新峰的出现所表明(表9)。新化合物的质谱给出了[M+H]+种和福洛氨糖片段的离子(142.3)。此外，补入环丁基和环丙基羧酸也引起相应17-假糖苷配基的蓄积。
表9
与从ery装载模块菌株即刺糖多孢菌13E分离的的化合物相比，证实了21-环丁基化合物和环丙基化合物是正确的结构。
实施例15从刺糖多孢菌21K2大规模发酵中分离新的代谢产物将刺糖多孢菌21K2的冰冻营养原液接种到CSM(50ml，在带弹簧的250mL Erlenmeyer瓶)中的刺糖多孢菌21K2初级营养预培养物中。如实施例6所述制备和孵育在营养培养基(250ml，在带弹簧的2LErlenmeyer瓶)中的次级预培养物。
如实施例6，制备十四升制备培养基，添加0.01％v/v PluronicL-0101(BASF)防泡剂。用次级预培养物以5％v/v接种制备培养基，并允许在20L搅拌的生物反应器中在实施例8所述条件下发酵7-10天。在26和37.5小时，2-甲基丁酸补入生物反应器至终浓度2mM，产生总的终浓度4mM。7天后收集发酵肉汤培养基并如实施例8所述提取。
含油残留物溶于甲醇(1.5ml)并如实施例8所述进行初次层析。混合含有21-脱乙基-21-异丙基spinosyn A的最初分离物的馏分并真空除去溶剂。残留物通过反相硅胶(Prodigy C18，5μm；10×250mm)进行层析，以5ml/分的流速用如下述梯度洗脱。
T＝0，55％B；T＝5，70％B；T＝35，95％B；T＝45，95％B。
每隔30秒收集馏分。混合含21-脱乙基-21-异丙基spinosyn A的馏分，真空除去乙腈，并使用C18-BondElute筒(200mg)浓缩样品。在重力下施加该样品，用水(10mL)洗涤并用甲醇(2×10mL)洗脱，接着真空除去溶剂。
干燥的样品溶于甲醇(0.5ml)并通过反向碱失活硅胶(hypersil-C18-BDS；4.6×250mm；5μm)进行层析。以1ml/分的流速，用醋酸铵(10mM)-甲醇-四氢呋喃(40∶45∶15)等梯度洗脱柱，UV检测(244nm)后收集三个主要成分。在这些条件下，截留时间如下spinosyn-D64.4分钟，21-脱乙基-21-异丙基spinosyn A67.8分钟和21-脱乙基-21-正丙基spinosyn A75.3分钟。真空干燥每个样品得到白色固体，通过其NMR和质谱来鉴定它。
21-脱乙基-21-正丙基spinosyn A(化合物23)具有下列特征分子量745分子式C42H67NO10UV(HPLC分析过程中通过二极管阵列检测)244nm电喷MS[M+H]+的m/z＝746.5；福洛氨糖(forosamine)片段离子在m/z＝142.2。
表10总结了21-脱乙基-21-正丙基spinosyn A在CDCl3中的1H和13C NMR化学迁移数据。
表10
化学迁移参照CHCl3在7.26ppm的质子。
21-脱乙基-21-异丙基spinosyn A(化合物9)具有下列特征分子量745分子式C42H67NO10UV(HPLC分析过程中通过二极管阵列检测)244nm电喷MS[M+H]+的m/z＝746.5；福洛氨糖(forosamine)片段离子在m/z＝142.2。
表11总结了21-脱乙基-21-异丙基spinosyn A在CDCl3中的1H和13C NMR化学迁移数据。
表11
化学迁移参照CHCl3在7.26ppm的质子；来自2D实验的13C数据。
混合含推定的21-脱甲基-21-仲丁基spinosyn A的最初馏分，真空除去乙腈，并使用C18-BondElute筒(200mg)浓缩。在重力下施加该样品，用水(10mL)洗涤并用甲醇(2×10mL)洗脱，接着真空除去溶剂。
推定的21-脱甲基-21-仲丁基spinosyn A(化合物11)具有下列特征分子量759分子式C43H69NO10UV(HPLC分析过程中通过二极管阵列检测)244nm电喷MS[M+H]+的m/z＝760.5；福洛氨糖(forosamine)片段离子在m/z＝142.2。
肉桂链霉菌巴豆酰-CoA还原酶的共表达在另一个方面，本发明提供了工程改造的刺糖多孢菌宿主，它提供改变的底物供应，使得天然聚酮合酶产生新产物。例如，肉桂链霉菌巴豆酰-CoA还原酶与spinosyn生物合成途径共表达产生新产物，其中装载模块另外合并乙基丙二酰-CoA产生21-脱乙基-21-正丙基spinosynsA和D，模块8的AT另外合并乙基丙二酰-CoA产生6-乙基spinosyn A。此外，这两个AT结构域都可接受乙基丙二酰-CoA产生6-乙基-21-脱乙基-21-正丙基spinosyn。
spinosyn装载模块包含KSqAT0ACP0，它主要使甲基丙二酰-CoA脱羧基以合并丙酸。含KSq的装载模块通常比缺乏它们的模块更特异。因此spinosyn装载模块偶尔接受丙二酰-CoA(天然产生少量spinosyn E)有趣且罕见，且如这里公开，当存在乙基丙二酰-CoA时，出人意料地接受它。
支持这个观念的证据，见实施例18和就在实施例22之前的讨论部分。
具有异源延伸模块的杂化spinosyn PKS本发明的另一个方面提供了包含异源延伸模块或具有异源AT结构域的spinosyn延伸模块的杂化spinosyn PKS。
AT结构域选择被并入正在生长的聚酮化合物链的延伸单位。在spinosyn生物合成中，延伸物主要是丙二酰-CoA。然而，模块3中的AT主要是甲基丙二酰-CoA特异的。它偶尔合并丙二酰-CoA，导致作为天然少量成分的spinosyn F的蓄积。模块8中的AT显示不严紧的特异性，主要合并丙二酰-CoA(得到spinosyn A)，但也合并显著量的甲基丙二酰-CoA(得到大约15％的spinosyn D)。在与甲基丙二酰-CoA的选择相关的区域中，模块8AT的氨基酸序列类似于其它AT结构域。因此我们提出在这个位置主要合并丙二酰-CoA是底物供应的反映，也是具有罕见不严紧特异性的AT结构域的反映。装载模块的AT对甲基丙二酰-CoA具有高度选择性，但是5-10％的时间合并丙二酰-CoA(导致天然少量成分spinosyn E的产生)。
用不同丙二酰-CoA选择性的异源AT结构域取代现存AT结构域产生将添加、除去或取代spinosyn聚酮化合物上的侧链的PKS。当异源AT结构域可合并细胞内不容易得到的延伸物分子时，可以包括附属基因以提供共同底物(Stassi等，1998)。例如，刺糖多孢菌基因组中没有明显编码巴豆酰-CoA还原酶的基因(C.Waldron，未发表的观察结果)，因此预期乙基丙二酰-CoA的供应在这个生物中是严格受限的。
构建一个系统以允许在spinosyn聚酮合酶的模块3内实施AT交换。模块3的AT天然合并甲基丙二酰-CoA并将16-甲基分支导入spinosyn。影响AT交换的一个方法是通过取代，它将产生具有与天然PKS相同转录物的菌株。可供选择的方法是通过单一整合，它将完整质粒序列置于spinosyn PKS基因中并需要导入的启动子驱动整合位点下游的基因。
下列实施例(实施例16-19)描述了涉及使用酶MscI亚克隆片段的AT结构域交换实验。由于环绕该位点的序列，dcm甲基化影响MscI。需要用MscI消化的质粒因此通过大肠杆菌ET12567即dcm菌株传递而产生未被dcm甲基化的DNA。
A.使用雷帕霉素PKS的模块2AT代替spinosyn模块3AT的杂化spinosyn PKS使用单一整合方法，产生了spinosyn PKS，其中模块3AT(甲基丙二酰-CoA特异性的)被雷帕霉素模块2AT(丙二酰-CoA特异性的)取代。所得菌株记做刺糖多孢菌7D23。7D23的PKS基因含有在天然spnA启动子控制下的spnA，spnB和截短的spnC，其后为质粒序列(包括安普霉素抗性标记)以及在引入的启动子控制下的杂化spnC和spnD和spnE。在7D23中，使用的异源启动子是普那霉素抗性的启动子。也可以使用其它启动子，例如具有相关活化剂actII-ORF4的启动子actI。
刺糖多孢菌7D23产生了四个预测的spinosyn类似物spinosyn F，spinosyn F 17-假糖苷配基，16-脱甲基spinosyn D和16-脱甲基spinosyn D 17-假糖苷配基。产量意外的高，仅比未工程改造的菌株低3倍(见实施例20内的表12)。以前已经鉴定了spinosyn F化合物是未工程改造的菌株中的少量成分，但PKS基因的这个操作导致它们的产量急剧增加。
假糖苷配基F的富足可能是福洛氨糖(forosamine)糖基转移酶对这个新底物的活性降低的反映。最终的糖基化发生在C17，因此相邻的C16甲基可能对底物识别很重要。
实施例16含具有侧翼限制性位点的spinosyn模块3AT的载体的构建见图7a和7b。使用pRHB3E11作为模板以及引物CR322(SEQID NO12)和CR323(SEQ ID NO13)通过PCR扩增spinosyn模块3AT结构域。这些引物导入侧接AT结构域的MscI和AvrII位点(SEQ ID NOS12和13的bp3-8)。973bp PCR产物被磷酰化并克隆进入先用SmaI消化和脱磷酸化的商业上可获得的pUC18。筛选含正确方向插入物的转化体并进行测序。以AvrII位点邻近于多接头HindIII位点的方向含有正确序列插入物的一个转化体记做pALK6。
使用pRHB3E11作为模板以及引物CR324(SEQ ID NO14)和CR332(SEQ ID NO15)通过PCR扩增Spinosyn模块3AT下游的侧翼区域。在完全与CR323相同的位置，引物CR324导入AvrII位点(SEQ ID NO14的bp3-8)，CR332结合序列中天然存在的PstI位点下游。1557bpPCR产物被磷酸化并克隆进入先用SmaI消化和脱磷酸化的商业上可获得的pUC18。筛选含正确方向插入物的转化体并进行测序。以AvrII位点邻接多接头HindIII位点的方向含有正确序列插入物的一个转化体记做pALK9。用AvrII和PstI消化pALK9。对1525bp片段进行凝胶纯化并克隆入用AvrII和PstI消化的pALK6，得到质粒pALK11。
构建pALK12来提供这个实验的合适多接头。用NdeI和PstI消化pALK6并与寡核苷酸CR328(SEQ ID NO16)和CR329(SEQ ID NO17)的退火接头连接。设计该接头是为了破坏NdeI位点和留下XbaI，EcoRV和PstI位点。用限制性酶消化分析含插入物的克隆，显示正确模式的单一克隆记做pALK12。
使用pRHB3E11作为模板以及引物CR330(SEQ ID NO18)和CR321(SEQ ID NO19)通过PCR扩增spinosyn模块3AT下游的侧翼区域。在spnC基因的ATG起始密码子处，引物CR330导入NdeI位点(SEQ ID NO18的bp18-23)，在与CR322相同位置处，CR321合并MscI位点(SEQID NO19的bp3-8)。1729bp PCR产物被磷酸化并克隆进入先用SmaI消化和脱磷酸化的商业上可获得的pUC18。筛选含正确方向插入物的转化体并进行测序。以MscI位点邻接多接头HindIII位点方向含有正确序列插入物的一个转化体记做pALK23。用PstI和XmnI消化pALK12，601bp克隆进入PstI/XmnI消化的pALK23得到pALK24。用PstI和MscI消化pALK11，2488bp片段连接入由PstI和MscI消化pALK24产生的3777bp主链得到pALK25。为了确保进行整合的充分同源性，从pRHB3E11切除从PstI位点(美国专利6,274,350B1的SEQ ID NO1的bp39607-39612)至MscI位点的DNA片段并克隆进入先用PstI和EcoRV消化的pALK25得到pALK26。
在实验中，pALK26是产生在模块3具有AT交换的spinosyn PKS基因的中间质粒。它含有具有侧翼限制性位点的spinosyn AT3，spnC上游区域至起始密码子，和进行同源重组的区域下游。就在AT边缘MscI位点上游，它缺乏407bp MscI-MscI片段，该片段需要在完成AT交换后插入。
实施例17可用于工程改造spinosyn生物合成途径而产生C16脱甲基spinosyns的载体的构建见图8。质粒pALK39用于通过同源重组整合到刺糖多孢菌的染色体中。它被设计成能将雷帕霉素AT2并入spinosyn模块3。这种工程改造的剌糖多孢菌菌株产生了C-16脱甲基spinosyns以及这个途径中的中间体。如下所述构建质粒pALK39。
从pCJR26切除雷帕霉素模块2作为MscI/AvrII片段(见SEQ IDNO 20)并连接到先用MscI和AvrII消化的pALK26，得到pALK28。从pALK24(实施例16)切除这个构建体中缺乏的407bp MscI片段并连接入脱磷酸化、MscI消化的pALK28。筛选含有正确插入方向的克隆，在正确方向含插入物的单一克隆记做pALK32。PALK32含有rap AT2交换进入刺糖多孢菌模块3所需的片段，并在起始密码子处有NdeI位点和就在聚酮合酶序列外部有下游XbaI位点。这个区域切除作为NdeI/XbaI片段并克隆进入pLSB3得到pALK39。因此新的模块3杂化片段在载体中置于Pptr之下，该载体可通过接合转移给剌糖多孢菌并使用安普霉素抗性进行选择。
实施例18 能够过度表达丙二酰-CoA还原酶的载体的构建见图9。为了解决底物供应问题，构建过度表达来自肉桂链霉菌的丙二酰-CoA还原酶(ccr)基因的pALK21。pALK21构建如下。
使用引物CCRMONF(SEQ ID NO21)和CCRMONR(SEQ ID NO22)，通过PCR从肉桂链霉菌ATCC 15413分离的基因组DNA扩增肉桂链霉菌ccr基因。CCRMONF引入了含有该基因起始密码子ATG的NdeI位点(SEQID NO21的bp7-12)，CCRMONR导入了终止密码子下游的BamHI位点(SEQ ID NO22的bp6-11)。在标准条件下使用Pwo耐热DNA聚合酶实施扩增以获得ccr基因。用T4多核苷酸激酶磷酸化该片段，接着克隆进入用SmaI消化和脱磷酸的商业上可获得的pUC18。对含插入物的质粒测序，含正确序列的一个质粒记做pLSB46。质粒pLSB46以导入的BamHI位点邻接多接头XbaI位点的方向含有肉桂链霉菌ccr基因。SEQ ID NO 23显示从起始密码子处的NdeI位点至终止密码子之后的BamHI位点的ccr基因。
切除ccr基因作为NdeI/XbaI片段并克隆进入用NdeI和XbaI消化的表达载体pLSB2(实施例2)，得到pLSB59。质粒pLSB59含有actI启动子控制下的ccr基因，和活化剂actII-ORF4。为了使ccr基因与工程改造的杂化PKS共表达，含ccr的片段连同actII-ORF4活化剂和actI启动子被转移到具有杂化PKS基因可利用的限制性位点的含第二个启动子(Pptr)的载体中。如下述完成此。
用NdeI消化pLSB59，使用DNA聚合酶I的Klenow片段补平末端。重新环化这个平末端片段得到pALK19。从pALK19切除该基因和启动子作为SpeI/XbaI片段并克隆进入SpeI消化的pLSB3(实施例2)。这个步骤破坏了ccr基因末端处的XbaI位点。所得质粒记做pALK21。质粒pALK21因此含有PactI下的ccr基因，具有用于将杂化PKS基因导入ptr启动子下游的独特NdeI和XbaI位点。pALK21是安普霉素抗性的并且含有用于接合转移DNA的oriT。
实施例19 含有杂化聚酮合酶的刺糖多孢菌菌株的产生，该合酶含有雷帕霉素模块2AT取代spinosyn模块3AT见
图11。通过大肠杆菌S17-1(Simon等，1983)的接合(Matsushima等1994)用pALK39转化刺糖多孢菌NRRL 18538。选择转化体的抗安普霉素的抗性。Southern印迹分析筛选大量转化体。显示正确杂交模式而表明该质粒已经通过同源重组整合到染色体的单一转化体记做刺糖多孢菌菌株7D23。
实施例20-21阐述了刺糖多孢菌7D23制备新的spinosyns的用途。
实施例20 16-脱甲基spinosyns的制备和分离(spinosyn F，spinosyn F假糖苷配基，和化合物21和22的制备)以前已经鉴定16-脱甲基spinosynA是由大量刺糖多孢菌菌株制备的spinosyns家族的一员，并记做spinosyn F(US 6,274,350B1)。这里我们示范了从刺糖多孢菌7D23的工程改造杂化途径制备spinosynF和16-脱甲基spinosyn D(化合物21)。
刺糖多孢菌7D23用于接种CSM培养基(Hosted和Baltz 1996；美国专利5,362,634)。这个预培养物在带有30cm弹簧以辅助换气的250ml瓶中，两英寸250rpm来回振荡，30℃，75％相对湿度下生长3天。接着用于以5％v/v接种营养培养基，置于含3×30ml培养物的250ml瓶(Strobel和Nakatsukasa 1993；US Pat.No.5,362,634)中，在相同条件下培养另外2天。营养培养物用于以5％v/v接种制备培养基，如上所述条件在含3×30ml培养物的250ml瓶中生长。刺糖多孢菌7D23的制备培养基生长10天。
对于代谢产物的鉴定，如实施例5所述用LC-MS分析1ml等分部分发酵肉汤培养基。通过与可信标准相比，很明显存在spinosyn F、16-脱甲基spinosyn D，以及它们相应的糖苷配基(表12)。
表12
离心澄清剩余的发酵肉汤培养基。用等体积甲醇提取细胞两次。用5N NaOH调节上清(780ml)至pH～10并用乙基醋酸酯(3×500ml)提取两次。混合甲醇和乙基醋酸酯提取物并真空除去溶剂得到含油残留物。残留物溶于乙基醋酸酯(250ml)中并用50mM酒石酸(3×200ml)提取。用5N NaOH调节混合的酒石酸提取物至pH～10，并用乙基醋酸酯(3×300ml)提取。混合提取物并真空除去溶剂，得到棕色油(200mg)。油溶于甲醇(1mL)，其中一半如实施例8所述进行初次层析。
混合含有16-脱甲基spinosyn D和spinosyn F的来自初次分离物的主要馏分并真空除去溶剂。残留物通过相同柱层析，以21ml/分的流速用如下述梯度洗脱。
T＝0分钟，35％B；T＝35，55％B；T＝45，55％B。
每隔30秒收集馏分。分别混合含16-脱甲基spinosyn D或spinosynF的馏分。每个混合组的馏分接着运行如下真空除去乙腈，并使用C18-BondElute筒(200mg)浓缩样品。在重力下施加该样品，用水(10mL)洗涤并用甲醇(2×10mL)洗脱，接着真空除去溶剂。
16-脱甲基spinosyn D(化合物21)具有下列特征分离产量4.8mg分子量731分子式C41H65NO10UV(HPLC分析过程中通过二极管阵列检测)244nm电喷MS[M+H]+的m/z＝732.5；福洛氨糖(forosamine)片段离子在m/z＝142.4。
准确FT-ICR-MS[M+H]+的m/z＝732.4689(需要732.4681)。
表13总结了16-脱乙基-spinosyn D在CDCl3中的1H和13C NMR化学迁移数据。
表13
化学迁移参照7.26ppm的质子。
*由于微量酸引起胺基质子化而未观察到。
spinosyn F具有下列特征分离产量5.5mg分子量717分子式C40H63NO10UV(HPLC分析过程中通过二极管阵列检测)244nm电喷MSMH+的m/z＝718.5；福洛氨糖(forosamine)片段离子在m/z＝142.4。
准确FT-ICR-MS[MH]+的m/z＝718.4534(需要718.4525)。
这个化合物累积的NMR数据与其建议的特性和公开的数据(美国专利5,362,634)一致。
实施例21 16-脱甲基spinosyn A 17-假糖苷配基(化合物22)的制备和分离以前鉴定了16-脱甲基spinosyn A 17-假糖苷配基并已知是spinosyn F 17-假糖苷配基。发现它是由刺糖多孢菌菌株制备的spinosyns家族的少数成员(美国专利6,274,350 B1)。下述是从刺糖多孢菌7D23的工程改造杂化途径制备spinosyn F 17-假糖苷配基和16-脱甲基spinosyn D 17-假糖苷配基的方法。
将刺糖多孢菌7D23的冰冻营养原液用于在CSM培养基中接种初级营养预培养物(50ml，在带有弹簧的250ml Erlenmeyer瓶中培养)。如实施例8所述制备和孵育营养培养基(250ml，在带弹簧的2L Erlenmeyer瓶中培养)中的次级预培养物。
如实施例6，制备四升制备培养基，添加0.01％v/v Pluronic L-0101(BASF)防泡剂。用次级营养预培养物以5％v/v接种制备培养基，并允许在7L搅拌的生物反应器中30℃发酵7-10天。气流设置在0.75vvm，为了保持溶解氧压力处于或高于30％空气饱和度，叶轮尖速度控制在0.68和1.1ms-1之间。
对于代谢产物的鉴定，如实施例5所述用LC-MS分析1ml等分部分发酵肉汤培养基。通过与可信标准比较，明显存在spinosyn F，16-脱甲基spinosyn D以及它们相应的假糖苷配基(表14)。
表14
离心澄清剩余的发酵肉汤培养基。用等体积甲醇提取细胞两次。用乙基醋酸酯(2×1.5L)提取上清(3.2L)。混合甲醇和乙基醋酸酯提取物并真空除去溶剂。残留油溶于乙基醋酸酯(1L)中并用50mM酒石酸(3×500ml)洗涤。真空蒸发剩余乙基醋酸酯溶液。所得油通过快速硅胶(6×13cm)进行层析，用含5％甲醇的氯仿洗脱。收集10ml体积的馏分。混合含假糖苷配基的馏分并真空除去溶剂得到棕色油。棕色油溶于甲醇(1.5ml)并如实施例8所述在碱失活的反相硅胶上进行层析。每隔30秒收集馏分。混合含相关产物的那些馏分，并真空除去乙腈，并使用C18-BondElute筒(200mg)浓缩样品。在重力下施加该样品，用水(10mL)洗涤并用甲醇(2×10mL)洗脱，接着真空除去溶剂。
16-脱甲基spinosyn D 17-假糖苷配基(化合物22)具有下列特征分离产量3.3mg
分子量590分子式C33H50O9UV(HPLC-MS分析过程中通过二极管阵列检测)240nm电喷MS[M+Na]+的m/z＝613.3。
准确FT-ICR-MS[M+H]+的m/z＝591.3517(需要591.3528)。
表15总结了16-脱甲基spinosyn D 17-假糖苷配基在CDCl3中的1H和13C NMR质谱数据。
表15
b.使用泰洛星PKS的5AT模块取代spinosyn模块3AT的杂化spinosyn PKS
以类似方法产生杂化spinosyn PKS，其中甲基丙二酰-CoA特异性模块3AT结构域被乙基丙二酰-CoA特异性泰洛星模块5AT结构域(SEQ ID NO26)取代。产生的菌株记做刺糖多孢菌36P4。预期刺糖多孢菌中乙基丙二酰-CoA不富足，因此在相同细胞中于actI启动子控制下表达编码巴豆酰-CoA还原酶的肉桂链霉菌基因。这应该明显增加丁酰-CoA的细胞内量，其中丁酰-CoA是可提供乙基丙二酰-CoA的短链脂肪酸羧化酶的底物。刺糖多孢菌36P4的PKS含有天然spnA启动子下的spnA，spnB和截短spnC，后面为包括安普霉素抗性标记的质粒DNA。ActI启动子下肉桂链霉菌巴豆酰-CoA和actII-ORF4活化剂也在该质粒序列中。这之后是普那霉素抗性的启动子控制下的杂化spnC(spnC*)基因。本领域技术人员将领会到可以交换异源启动子，或实际上领会可以选择很多其它启动子。
刺糖多孢菌菌株36P4产生具有与期望16-脱甲基-16-乙基spinosyns A和D一致的UV吸光度、层析特性、质量和片段化模式的少量成分。来自刺糖多孢菌菌株36P4的主要产物是spinosyns A和D。奇怪的是，刺糖多孢菌36P4占优势的新发酵产物是21-脱乙基-21-正丙基spinosyn A和6-乙基spinosyn A。21-脱乙基-21-正丙基spinosyn A产生的水平是spinosyn D的10％以内。分离这些化合物并用MS和NMR完全描述其特征。我们提出由于乙基丙二酰-CoA的细胞内浓度增加而产生了它们，其中乙基丙二酰-CoA由导入巴豆酰-CoA还原酶基因造成。装载模块AT和模块8AT的低特异性允许合并这个新底物。6-乙基-21-脱乙基-21-正丙基spinosyn A也由刺糖多孢菌36P4产生，作为较少因素。这三个产物每个在C16都具有甲基，暗示在这个系统中，泰洛星模块5AT主要合并甲基丙二酰-CoA。因此预期在ccr基因存在下，未工程改造的spinosyn PKS(具有天然AT3)将产生21-正丙基和6-乙基spinosyn化合物。
实施例22 可用于工程改造spinosyn生物合成途径而产生16-脱甲基-16-乙基spinosyns的载体的构建见
图10。质粒pTB4是基于pUC18的质粒，含有包括泰洛星模块4的大部分的泰洛星PKS的BamHI片段。这个插入物来自保藏序列tylG.embo(保藏号U78289)的bp24125和24130之间(从KS4开始处)的BamHI位点和bp31597和31612之间(从KS5开始处)的BamHI位点。
使用pTB4作为模板以及引物AK1(SEQ ID NO24)和AK2(SEQID NO25)通过PCR扩增泰洛星模块5。在AT结构域开始处，引物AK1导入MscI位点(SEQ ID NO24的bp3-8)和在AT结构域末端，引物AK2导入AvrII位点(SEQ ID NO25的bp3-8)。在标准条件下使用Pwo耐热DNA聚合酶实施PCR反应。用T4多核苷酸激酶磷酸化该片段并克隆进入用SmaI消化和去磷酸化的商业上可获得的pUC18。分析含正确方向插入物的质粒并进行测序。鉴定了含有正确序列的一个质粒并记做pALK17。它以MscI位点邻接多接头的HindIII位点的方向含有该PCR片段。从pALK17切除tyl AT5作为MscI/AvrII片段并克隆进入用MscI和AvrII消化的pALK26得到pALK27。从pALK24(实施例16)切除这个构建体中缺乏的407bpMscI片段并连接进入去磷酸化的MscI消化的pALK27。含有正确方向插入物的单一克隆记做pALK31。pALK31含有将tyl AT5交换导入刺糖多孢菌模块3所需的片段，并且在起始密码子处具有NdeI位点和就在聚酮合酶序列下游具有XbaI位点。切除这个片段成为NdeI/XbaI片段并克隆进入pALK21得到pALK36。这将新的模块3杂化片段在载体中置于Pptr之下，该载体从actI启动子共表达ccr，并可以通过接合转移到剌糖多孢菌并使用安普霉素抗性进行选择。
实施例23 含有杂化聚酮合酶的刺糖多孢菌菌株的产生，该合酶含有泰洛星模块5AT取代spinosyn模块3AT，并提供适当的乙基丙二酰-CoA共底物见
图12。用pALK36转化刺糖多孢菌NRRL 18538。选择转化体的安普霉素抗性并用Southern印迹分析来筛选。单一转化体记做刺糖多孢菌菌株36P4。
实施例24 从刺糖多孢菌36P4制备和分离化合物将刺糖多孢菌36P4的冰冻营养原液接种到CSM(50ml，在250ml带有弹簧的Erlenmeyer瓶中孵育)中的初级营养预培养物中。如实施例8所述制备和孵育营养培养基中的次级预培养物。
如实施例6，制备十四升制备培养基，添加0.01％v/v PluronicL-0101(BASF)防泡剂。用次级营养预培养物以5％v/v接种制备培养基，并允许在20L搅拌的生物反应器中在实施例8所述条件下发酵7-10天。
对于代谢产物的鉴定，如实施例5所述用LC-MS分析1ml等分部分发酵肉汤培养基。通过与可信标准，以及与来自刺糖多孢菌菌株NRRL18538的发酵提取物比较，证实了新spinosyn代谢产物的存在(表16)。用与spinosyn D类似但不同的截留时间洗脱得到了主要新成分，并具有等同质量；这个化合物下面鉴定为21-脱乙基-21-正丙基spinosynA。随后洗脱了第二个显著的新成分，其质量比spinosyn D高14个单位；该化合物下面称为6-乙基spinosyn A。随后仍洗脱第三个明显峰并具有比spinosyn D高28个单位的质量；据信这个化合物是6-乙基-21-脱乙基-21-正丙基spinosyn A。所有这些化合物的质谱显示[M+H]+离子加福洛氨糖(forosamine)片段。此外，清晰存在几个其它新成分，但以少量存在。在第一主要新成分之后洗脱了这些新成分之一并具有与spinosyn D等同的质量；这个化合物可能是16-脱甲基-16-乙基spinosyn A。其它少量新成分显示高于spinosyn D14个质量单位的[M+H]+离子以及与福洛氨糖(forosamine)片段一致的质量。这些少量新成分之一可能是16-脱甲基-16-乙基spinosyn D。
表16
离心澄清剩余的发酵肉汤培养基(12L)并如实施例8所述进行提取。残留物溶于甲醇(10ml)，水(2ml)和甲酸(100μl)。过滤整个样品并在重力下施加到C18-BondElute SPE筒(70g，150ml)。使用FlashMaster Personal系统(Jones Chromatography，Wales UK)用含0.1％甲酸的10％步长的乙腈水溶液梯度(100ml每步骤)处理该筒。最后用甲醇(2×100ml)洗涤柱。混合含746amu或更高质量的spinosyn样分子的馏分并真空除去溶剂。残留油(3ml)溶于甲醇(1.5ml)。如实施例8所述以两个等分对这个样品进行初次层析。
混合来自最初分离物对的含有6-乙基spinosyn A和21-脱乙基-21-正丙基spinosyn D(m/z＝760)的馏分并真空除去溶剂。该残留物溶于甲醇(1ml)并通过反相硅胶(Hypersil C18-BDS，5um；21×250mm)进行层析，以21ml/分的流速，用如下所述的梯度洗脱。
T＝0分钟，40％B；T＝80，50％B。
每隔30秒收集馏分。混合主要含有6-乙基spinosyn A的馏分，真空除去乙腈，并使用C18-BondElute筒(200mg)浓缩样品，用水(10ml)洗涤并用甲醇(2×10ml)洗脱，并真空除去溶剂。混合来自最初分离物对的主要含21-脱乙基-21-正丙基spinosyn A(m/z＝746)的馏分并真空除去溶剂。残留物溶于甲醇∶水(7∶3，1ml)并通过相同柱进行层析，用下列梯度以21ml/分洗脱。
T＝0分钟，40％B；T＝45，80％B。
每隔30秒收集馏分。混合仅含21-脱乙基-21-正丙基spinosyn A的馏分。分别混合含这个化合物与spinosyn D的混合物的样品，真空除去溶剂，残留物如上所述再次层析。接着仅含21-脱乙基-21-正丙基spinosyn A的馏分与第一次运行所得的那些混合。混合含这两种化合物的混合物的馏分并执行另一轮层析。
混合这三次运行所得的仅含21-脱乙基-21-正丙基spinosyn A的馏分，真空除去乙腈，并使用C18-BondElute筒(200mg)浓缩样品。在重力下施加该样品，用水(10mL)洗涤，用甲醇(2×10mL)洗脱，真空除去溶剂。
6-乙基spinosyn A(化合物24)具有下列特征分离产量4.8mg分子量759分子式C43H69NO10UV(HPLC分析过程中通过二极管阵列检测)244nm电喷MSMH+的m/z＝760.5；福洛氨糖(forosamine)片段离子在m/z＝142.4。
准确FT-ICR-MS[MNa]+的m/z＝782.4818(需要782.4814)。
表17总结了6-乙基-spinosyn A在CDCl3中的1H和13C NMR化学迁移数据。
表17
化学迁移参照CHCl3在7.26ppm的质子。
21-脱乙基-21-正丙基spinosyn D(化合物28)具有下列特征分离产量～1mg分子量759分子式C43H69NO10这个化合物以少量成分存在，与6-乙基spinosyn A成4∶1的混合物。不能区别这两个化合物的累积UV和MS数据。使用NMR方法，从该混合物的COSY光谱观察到的相关性可分配21-正丙基旋转系统。甲基H24(δH0.87，dd，7.3Hz，7.3Hz)与亚甲基H23(δH1.23，m)相关。H23与亚甲基H22(δH1.43，m)相关，H22依次与H21(δH4.73，m)相关。在混合物的1H NMR谱中可见H21共振是分离的多重峰。
21-脱乙基-21-正丙基spinosyn A(化合物23)具有下列特征。
分离产量5.1mg分子量745分子式C42H67NO10UV(HPLC分析过程中通过二极管阵列检测)244nm电喷MSMH+的m/z＝746.5；福洛氨糖(forosamine)片段离子在m/z＝142.4。
这个化合物的累积NMR数据等同于实施例15中这个化合物描述的那些。
通过spn延伸模块内其它AT(酰基转移酶)结构域的取代而构建的杂化PKS基因可用于产生在聚酮化合物上的其它位置具有改变侧链的新spinosyns。例如，在与上述类似的方法中，可构建杂化聚酮合酶来产生spinosyns，其中C18或C20具有除氢以外的侧链(通常是甲基或乙基)。主要合并甲基丙二酰-CoA的天然AT结构域(如spn AT3)可被优选合并丙二酰-CoA(如雷帕霉素AT2)或乙基丙二酰-CoA(如泰洛星AT5)的异源结构域取代。然而，本领域技术人员将意识到这些杂化聚酮合酶的供体结构域或模块可从各种I型聚酮合酶簇获得，并且不以任何方式限于来自红霉素、阿弗菌素、雷帕霉素和泰洛星生物合成的结构域或模块。
也预期组合操作应该产生多产性生物合成途径，以及具有两个或更多新区域的spinosyns。
可能需要另外的生物合成基因来提供通常不并入spinosyns的前体的足够供应，如ccr基因来增加乙基丙二酰-CoA供应。通过提供合并入其它spn AT结构域的非自然前体，这个基因修饰也可以导致新的spinosyns的产生。其它spn AT结构域的取代将产生杂化PKS基因，它导致在C6具有乙基，或在C18或C20具有甲基或乙基侧链的spinosyns的合成。负责每个β-酮基团(KR，DH或ER)的修饰程度的spn PKS结构域也可以被异源结构域取代而产生杂化PKS基因，进而产生具有不同的饱和键，羟基或双键的spinosyns。
总之，我们证明了这里要求保护的杂化spinosyn PKS基因可有效制备新的杀昆虫活性的spinosyns。该杂化基因是由与其它I型PKS基因的一部分或多部分组合的spn PKS基因得到的。WO98/01546″Polyketides and their synthesis″中描述的策略用于选择该DNAs被拼接在一起的位点。该杂化基因可以可操作连接异源启动子，如来自放线菌紫素生物合成基因actI的那些(连同编码其相关活化剂的actII-ORF4基因，见WO 98/01546)，或来自普那霉素抗性基因ptr的(Blanc等，1995)。该杂化PKS基因在也含有产生生物活性spinosyn所需的非PKS功能的生物中表达。可以使用常规方案(如美国专利5,362,634所述)培养本发明提供的修饰菌株以提供spinosyns。
可想到本发明的杂化spinosyn PKSs不仅可以在刺糖多孢菌中表达，而且可以在其它宿主生物表达，例如红色糖多孢菌，来产生杀昆虫活性的spinosyns。属于放线菌类别，优选链霉菌类别的其它原核生物细胞也是合适的宿主生物。白色链霉菌(Streptomyces albus)是具体实例。
新spinosyns的杀虫活性这里要求保护的化合物可有效控制昆虫和螨。包括该化合物的所有异构体，和该化合物及其异构体的任何酸加成盐。也包括美国专利6,001,981所述制备其它修饰的spinosyns的方法制成的半合成衍生物。
该化合物显示抗很多昆虫和螨的活性。更特别地，该化合物显示抗鳞翅目昆虫成员的活性，如甜菜夜蛾，烟芽夜蛾，苹蠹蛾和菜尺蛾。它们也显示出抗鞘翅目(甲虫和象虫)和双翅目(蚊蝇)成员的活性。该化合物也显示出抗半翅类(trus bugs)，同翅目(蚜虫和蝻)，缨翅目(蓟马)，直翅目(蠊)，蚤目(跳蚤)，isoptera(白蚁)和膜翅目Formicidae(蚂蚁)成员的活性。该化合物也显示出抗二点叶螨的活性，它是蛛形纲蜱螨目的成员。
本发明的进一步方面涉及抑制昆虫或螨的方法。在一个优选实施方案中，本发明涉及抑制易感昆虫的方法，包括给植物应用灭活昆虫有效量的根据本发明的化合物。要求保护的化合物以组合物形式应用，该组合物也是本发明的一部分。这些组合物包括惰性载体中的灭活昆虫或螨有效量的化合物。该活性成分可以以要求保护的单一化合物，两个或更多化合物的混合物或任何化合物连同产生它的发酵培养基的干燥部分的混合物而存在。根据农业或控制害虫领域中的常规步骤和方案制备组合物，但该步骤和方案是新的和重要的，因为存在本发明的一个或更多化合物。该化合物可以是浓缩制剂，它分散于水中或可以是粉剂、饵或颗粒制剂形式，可以不进一步处理而使用。
通过添加其它，例如杀昆虫、杀螨和/或杀线虫活性的成分，根据本发明的组合物的作用可以得到增强。例如，一个或更多下列化合物可以合适地与本发明化合物组合有机磷化合物、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、酰基脲、其它类型的昆虫生长调节剂和昆虫激素类似物、neonicotinoids和其它尼古丁、大环内酯和其它杀昆虫、杀螨、mollscicial和杀线虫化合物或活性剂。WO 00/56156的″SynergisticInsecticide Mixtures″公开了某些已知spinosyn化合物与尼古丁乙酰胆碱受体的激动剂或拮抗剂组合控制动物害虫的用途。WO 00/35282的″Combination of Active Ingredients″公开了多杀菌素与杀真菌活性化合物组合的用途。WO 00/35286的″Combinations of ActiveIngredients″公开了多杀菌素与其它化合物组合控制动物昆虫和真菌。WO 99/60856的″Use of Spinosyns as Soil Insecticides″公开了某些已知spinosyns通过土壤或通过灌溉处理种子和应用给植物而控制昆虫的用途。WO 99/33343的″Use of Macrolides in Pest Control″公开了spinosyns控制转基因庄稼的用途，spinosyns在保护较晚形成的植物繁殖材料和植物器官以防害虫攻击中的用途，和spinosyns控制木材害虫和软体动物的用途。通式I的化合物也可以用于这些目的。
本发明的化合物也可以有效控制节肢动物来治疗动物，即昆虫和蛛形纲动物包括各种蝇和蝇幼虫、跳蚤、虱、螨和蜱，它们是动物上的害虫。送递杀外寄生虫剂(ectoparasiticide)的技术是本领域技术人员熟知的。通常，本化合物通过喷雾、浸剂(dip)或粉剂应用于动物的外表面。也可以使用美国专利4,265,876中公开的传递方法即耳签将该化合物传递给动物。
仍在另一个实施方案中，该化合物可以用于控制是牛和其它动物粪便中害虫的昆虫和蛛形纲动物。在这个实施方案中，该化合物可以经口给予，且该化合物移动通过肠道并出现在粪便中。粪便中昆虫的控制间接保护动物不受害虫的侵害。
本发明的化合物也可以有效作为人药物来控制寄生虫，例如虱。该化合物也可以用于例如WO 00/01347中公开的控制虱的制剂。
实施例25 新纯化的spinosyns是杀昆虫剂的证明局部试验表明了本发明化合物的生物活性，在该试验中该化合物以1微克/幼虫的比率应用于实验室养育的幼虫(平均体重22mg)。含每个化合物的丙酮溶液(1mg/ml)沿着六只烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)幼虫和六只甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)幼虫的背部应用。处理的幼虫接着在21℃，60％RH，六孔塑料培养皿中保持2天。在处理后的两天间隔期间，给每只幼虫供应1cm3的基于琼脂的鳞翅目饮食来维持。在两天期末确定死亡率百分比(表18)。
表18
通式(I)的化合物可以在US 6,001,981中公开的方法中用作中间体来制备半合成spinosyn类似物，也预期该类似物具有杀昆虫剂活性。
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<223>人工序列描述寡核苷酸CR312<400>5gttctagata cttgcagcat atgcgtccga actagtgata tctg 44<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
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aggacacata tggcggacct gtcaaagctc tc 32<210>7<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸SP29<400>7cccgctagcg gttcgccggg cgccgcttcg ttgg 34<210>8<211>1685<212>DNA<213>红色糖多孢菌<400>8catatggcgg acctgtcaaa gctctccgac agtcggactg cacaacctgg gaggatcgtt 60cgtccgtggc ccctgtcggg gtgcaatgaa tccgccttgc gggcccgtgc gcgccaattg 120cgtgcacatc tcgatcgatt tcccgatgcc ggtgtcgaag gtgtcggggc cgcgctcgcg 180cacgacgagc aggcggacgc cggtccgcat cgcgcggtcg tcgtcgcctc ctcgacctcc 240gagctgctcg acggcctggc cgccgtcgcc gacggccggc cgcacgcctc ggtggtccgc 300ggcgtggccc ggccgtccgc gccggtggtg ttcgtcttcc cgggccaggg cgcgcaatgg 360gccgggatgg cgggcgaact cctcggcgag tcaagggttt tcgccgccgc gatggacgcg 420tgcgcgcggg cgttcgagcc cgtgaccgac tggacgctgg cgcaggtcct ggactctccc 480gagcagtcgc gccgcgtcga ggtcgtccag cccgccctgt tcgcggtgca gacgtcgctg 540gccgcgctct ggcgctcctt cggcgtgacc cccgacgccg tggtgggcca cagcatcggc 600gagctggccg ccgcgcacgt gtgcggtgcg gccggtgccg ccgacgccgc gcgcgccgcc 660gcgctgtgga gccgcgagat gattccgttg gtgggcaacg gcgacatggc agccgtcgcg 720ctctccgccg acgagatcga gccgcgcatc gcccggtggg acgacgacgt ggtgctggcc 780ggggtcaacg gtccgcgctc ggttctgctg accgggtcgc cggaaccggt cgcgcgccgg 840gtccaggagc tctcggccga gggggtccgc gcacaggtca tcaatgtgtc gatggcggcg 900cactcggcgc aggtcgacga catcgccgag gggatgcgct cggccctggc gtggttcgcg 960cccggtggct cggaggtgcc cttctacgcc agcctcaccg gaggtgcggt cgacacgcgg 1020gagctggtgg ccgactactg gcgccgcagc ttccggctgc cggtgcgctt cgacgaggcg 1080atccggtccg ccctggaggt cggtcccggc acgttcgtcg aagcgagccc gcacccggtg 1140ctggccgccg cgctccagca gacgctcgac gccgagggct cctcggccgc ggtggtcccg 1200acgctgcaac gcgggcaggg cggcatgcgg cggttcctgc tggccgcggc ccaggcgttc 1260accggcggcg tggccgtcga ctggaccgcc gcctacgacg acgtgggggc cgaacccggc 1320tctctgccgg agttcgcgcc ggccgaggag gaagacgagc cggccgagtc cggcgtcgac 1380tggaacgcgc caccgcacgt gctgcgcgag cggctgctcg cggtcgtcaa cggcgagacc 1440gccgcgttgg cgggccgcga agccgacgcc gaggccacgt tccgcgagct ggggctggac 1500
tcggtgctgg ccgcgcagct gcgcgccaag gtgagcgccg cgatcgggcg cgaggtcaac 1560atcgccctgc tctacgacca cccgactccg cgtgcgctcg cggaagcact cgcggcggga 1620accgaggtcg cacaacggga aacccgcgcg cggaccaacg aagcggcgcc cggcgaaccg 1680ctagc 1685<210>9<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸SP14<400>9aagctagccg tgatcgggat gggctgtcgg tt 32<210>10<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸SP15<400>10atagcggccg cccccagccc ccacagatcc ggtcaccaa39<210>11<211>1694<212>DNA<213>除虫链霉菌<400>11catatggcgg acctgtcaaa gctctccgac agtcggactg cacaacctgg gaggatcgtt 60cgtccgtggc ccctgtcggg gtgcaatgaa tccgccttgc gggcccgtgc gcgccaattg 120cgtgcacatc tcgatcgatt tcccgatgcc ggtgtcgaag gtgtcggggc cgcgctcgcg 180cacgacgagc aggcggacgc cggtccgcat cgcgcggtcg tcgtcgcctc ctcgacctcc 240gagctgctcg acggcctggc cgccgtcgcc gacggccggc cgcacgcctc ggtggtccgc 300ggcgtggccc ggccgtccgc gccactagtc ttcgtttttc ccgggcaggg cccgcaatgg 360ccgggcatgg gaagggaact tctcgacgct tccgacgtct tccgggagag cgtccgcgcc 420tgcgaagccg cgttcgcgcc ctacgtcgac tggtcggtgg agcaggtgtt gcgggactcg 480ccggacgctc ccgggctgga ccgggtggac gtcgtccagc cgaccctgtt cgccgtcatg 540atctccctgg ccgccctctg gcgctcgcaa ggggtcgagc cgtgcgcggt gctgggacac 600agcctgggcg agatcgcggc agcccacgtc tcgggaggcc tgtccctggc cgacgccgca 660
cgcgtggtga cgctttggag ccaggcacag accacccttg ccgggaccgg cgcgctcgtc 720tccgtcgccg ccacgccgga tgagctcctg ccccgaatcg ctccgtggac cgaggacaac 780ccggcgcggc tcgccgtcgc agccgtcaac ggaccccgga gcacagtcgt ttccggtgcc 840cgcgaggccg tcgcggacct ggtggccgac ctcaccgccg cgcaggtgcg cacgcgcatg 900atcccggtgg acgttcccgc ccactccccc ctgatgtacg ccatcgagga acgggtcgtc 960agcggcctgc tgcccatcac cccacgcccc tcccgcatcc ccttccactc ctcggtgacc 1020ggcggccgcc tcgacacccg cgagctagac gcggcgtact ggtaccgcaa catgtcgagc 1080acggtccggt tcgagcccgc cgcccggctg cttctgcagc aggggcccaa gacgttcgtc 1140gagatgagcc cgcacccggt gctgaccatg ggcctccagg agctcgccgc ggacctgggc 1200gacaccaccg gcaccgccga caccgtgatc atgggcacgc tgcgccgcgg ccagggcacc 1260ctggaccact tcctgacgtc tctcgcccaa ctacgggggc atggtgagac gtcggcgacc 1320accgtcctct cggcacgcct gaccgcgctg tcccccacgc agcagcagtc gctgctcctg 1380gacctggtgc gcgcccacac catggcggtg ctgaacgacg acggaaacga gcgcaccgcg 1440tcggatgccg gcccatcggc gagtttcgcc cacctcggct tcgactccgt catgggtgtc 1500gaactgcgca accgcctcag caaggccacg ggcctgcggt tgcccgtgac gctcatcttc 1560gaccacacca cgccggccgc ggtcgccgcg cgccttcgga ccgcggcgct cggccacctc 1620gacgaggaca ccgcgcccgt accggactca cccagcggcc acggaggcac ggcagcggcg 1680gacgacccgc tagc 1694<210>12<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸CR322<400>12aatggccagg gctggcagtg ggccggtatg gca 33<210>13<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸CR323<400>13aacctaggaa cgccacggcc cagtccacgg t31<210>14<211>29<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸CR324<400>14aacctaggcg cgggccgacg gctggacct 29<210>15<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸CR325<400>15cgacacgcac gtctcatcct ggtcaa 26<210>16<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸CR328<400>16tatcactcta gaccagatat ccagctgca 29<210>17<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸CR329<400>17gctggatatc tggtctagag tga 23<210>18<211>38<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸CR330<400>18ttcctggagg gaaacgccat atgtcgaatg aagagaag 38<210>19<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸CR321<400>19tttggccagg gaagacgaag acgacctcgc cgtc 34<210>20<211>837<212>DNA<213>吸水链霉菌<400>20tggccagggg tcgcagcgtg ctggtatggg tgaggaactg gccgccgcgt tccccgtctt 60cgcgcggatc catcagcagg tgtgggatct gctggatgtg cccgatctcg atgtgaatga 120gaccgggtat gcccagccgg ccctgttcgc tttgcaggtg gctctgttcg ggttgctgga 180atcgtggggt gtacggccgg atgcggtggt cggtcactct gtcggtgagc tcgccgccgg 240atacgtctcc gggttgtggt cgttggagga tgcctgcact ttggtgtcgg cgcgggctcg 300tctgatgcag gctctgcctg cgggtggggt gatggtcgct gtcccggtct cggaggatga 360ggctcgggcc gtgctgggtg agggtgtgga gatcgccgcg gtcaacgggc cgtcgtcggt 420ggttctctcc ggtgatgagg ccgccgtgct gcaggccgcg gaggggctgg ggaagtggac 480gcggctggcg accagtcacg cgttccattc cgcccgtatg gaaccgatgc tggaggagtt 540ccgggcggtc gctgaaggcc tgacctaccg gacgccgcag gtcgccatgg ccgctggtga 600tcaggtgatg accgctgagt actgggtgcg gcaggtccgg gacacggtcc ggttcggcga 660gcaggtggcc tcgttcgagg atgcggtgtt cgtcgagctg ggtgccgacc ggtcactggc 720ccgcctggtc gatggcatcg cgatgctgca cggtgaccat gaggcgcagg ccgctgtcgg 780tgccctggct cacctgtacg tgaacggcgt gagtgtcgag tggtccgcgg tcctagg837<210>21<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸CCRMONF<400>21ggcaaacata tgaaggaaat cctggacgcg 30<210>22<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸CCRMONR<400>22tccgcggatc ctcagtgcgt tcagatcagt gc 32<210>23<211>1394<212>DNA<213>Streptomyces cinnamonensis<400>23catatgaagg aaatcctgga cgcgattcag gcccagaccg cgaccgcgag cggcaccgcc 60gcggtcacgt ccgccgactt cgccgctctc cccctgcccg actcgtaccg cgcgatcacc 120gtgcacaagg acgagacgga gatgttcgcg ggcctcgagt cccgtgacaa ggacccccgc 180aagtcgctcc atctggacga cgtgccgatc cccgaactcg gccccggtga ggccttggtg 240gccgtcatgg cctcctcggt caactacaac tccgtgtgga cctcgatctt cgagcccgtc 300tccaccttca gcttcctgga gcggtacggc cggctcagcg acctgagcaa gcgccacgac 360ctgccgtacc acatcatcgg ctccgacctg gcgggcgtcg tgctgcgcac cgggcccggc 420gtgaacgcct ggaacccggg cgacgaggtc gtcgcgcact gcctgagcgt cgagctggag 480tcctccgacg gccacaacga cacgatgctc gaccccgagc agcgcatctg gggcttcgag 540accaacttcg gcggtctcgc cgagatcgcg ctcgtcaagt ccaaccagct catgccgaag 600cccggtcacc tgagctggga ggaggccgcc tcgcccggcc tggtgaactc caccgcgtac 660cgccagctgg tgtcccgcaa cggcgccggc atgaagcagg gcgacaacgt gctgatctgg 720ggcgcgagcg gcggactcgg gtcgtacgcc acgcagttcg cgctcgccgg cggcgccaac 780cccatctgtg tcgtctccag cccccagaag gcggagatct gccgcgcgat gggcgccgag 840gcgatcatcg accgcaacgc cgagggctac aagttctgga aggacgagca gacccaggac 900cccaaggagt ggaagcgctt cggcaagcgc atccgcgagc tcaccggcgg cgaggacatc 960gacatcgtct tcgagcaccc cggccgcgag accttcggcg cctcggtcta cgtcacgcgc 1020aagggcggca ccatcaccac ctgcgcctcg acctcgggct acatgcacga gtacgacaac 1080cgctacctgt ggatgtccct gaagcgcatc atcggctcgc acttcgccaa ctaccgcgag 1140gcgtgggagg ccaaccgcct gatcgccaag ggcaagatcc acccgacgct ctccaagacg 1200
taccgcctgg aggacaccgg ccaggccgcc tacgacgtcc accgcaacct ccaccagggc 1260aaggtcggcg tcctcgccct cgcgcccgag gagggcctgg gcgtgcgcga cccggagaag 1320cgggcccagc acatcgacgc gatcaaccgt ttccgcaacg tctgaacgca ctgatctgaa 1380cgcactgagg atcc 1394<210>24<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸AK1<400>24aatggccagg gctcgcagtg gccgtcgatg gccc 34<210>25<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸AK2<400>25ttcctaggaa gagggcttct ccgtcgatct ccagtc 36<210>26<211>972<212>DNA<213>弗氏链霉菌<400>26tggccagggc tcgcagtggc cgtcgatggc ccgggacctg ctcgaccgcg cgcccgcctt 60ccgcgagacg gcgaaggcct gcgacgccgc gctgagcgtc catctggact ggtccgtgct 120cgatgtcctc caggagaagc cggacgcgcc gccgctgagc cgggtcgacg tggtgcagcc 180cgtgctgttc acgatgatgc tgtcgctcgc cgcctgctgg cgggacctcg gcgtccaccc 240ggccgccgtg gtgggccact cccagggaga gatcgcggcg gcctgcgtgg ccggcgcgct 300ctccctggag gacgcggcgc ggatcgtggc gctgcgcagc cgggcatggc tcacactggc 360cggcaagggc ggcatggccg ccgtctccct gccggaagcc cggctgcgcg agcggatcga 420gcggttcggg cagcggctgt cggtggccgc ggtgaacagc ccgggcacgg cggcggtcgc 480cggtgacgtg gacgcgctgc gggaactgct ggcggagctg accgcggagg gcatccgggc 540caagccgatc cccggcgtgg acacggccgg ccactccgcg caggtggacg gcctgaagga 600gcatctcttc gaggtgctgg cgccggtctc cccgcgctcc tcggacatcc cgttctactc 660
gacggtgacg ggcgcgccgc tggacaccga gcggctggac gccgggtact ggtaccgcaa 720catgcgggag cccgtggagt tcgagaaggc cgtcagggca ctgatcgccg acggctacga 780cctgttcctg gagtgcaacc cgcacccgat gctcgccatg tcgctggacg agacactcac 840cgacagcggc ggccacggca ccgtgatgca caccctccgc cggcagaagg gcagcgccaa 900ggacttcggc atggcgctct gcctcgccta tgtcaacgga ctggagatcg acggagaagc 960cctcttccta gg 97权利要求
1.通式(I)的化合物 其中R1是氢、甲基或乙基；R2是氢、甲基或乙基；R3是氢， 或 R4是甲基或乙基，可以被一个或多个选自卤素、羟基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷硫基或氰基的基团取代；R4是α-分支C3-C5烷基、C3-C8环烷基或C3-C8环烯基，可以被一个或多个选自卤素、羟基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷硫基或氰基的基团取代；或R4是含有O或S的3-6员杂环基，其为饱和的或完全或部分不饱和的，且可以被一个或多个选自卤素、羟基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷硫基或氰基的基团取代；R5是氢或甲基；R6是氢或甲基；R7是氢或甲基；R8是氢、甲基、或乙基；R9是氢、甲基、或乙基；或者通式I化合物的5，6-二氢衍生物，前提是该化合物具有至少一个下列特征a)R4是被一个或多个选自卤素、羟基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷硫基或氰基的基团取代的甲基或乙基；或b)R4是α-分支C3-C5烷基、C3-C8环烷基、或C3-C8环烯基、可以被一个或多个选自卤素、羟基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷硫基或氰基的基团取代；或c)R4是含有O或S的3-6员杂环基，其为饱和的或完全或部分不饱和的，且可以被一个或多个选自卤素、羟基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷硫基或氰基的基团取代；或d)R1或R2是乙基；或e)R8是甲基或乙基；或f)R9是甲基或乙基。
2.权利要求1的化合物，其中R1是乙基。
3.权利要求1的化合物，其中R2是乙基。
4.权利要求1的化合物，其中R4是被一个或多个选自卤素、羟基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷硫基或氰基的基团取代的甲基或乙基；或α-分支C3-C5烷基、C3-C8环烷基、或C3-C8环烯基，其中所述任一基团可以被一个或多个选自卤素、羟基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷硫基或氰基的基团取代；或含有O或S的3-6员杂环基，其为饱和的或完全或部分不饱和的，且可以被一个或多个选自卤素、羟基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷硫基或氰基的基团取代。
5.权利要求4的化合物，其中R4是可用作ery或ave装载模块底物的羧酸残基。
6.权利要求4的化合物，其中R4是正丙基、异丙基、环丙基、甲基环丙基、仲丁基、环丁基、甲基硫代或呋喃基。
7.选自下组的化合物21-脱乙基-21-环丙基spinosyn A；21-脱乙基-21-环丙基spinosyn D；21-脱乙基-21-环丁基spinosyn A；21-脱乙基-21-环丁基spinosyn D；21-脱乙基-21-甲基硫代甲基spinosyn A；21-脱乙基-21-甲基硫代甲基spinosyn D；21-脱乙基-21-氰基甲基spinosyn A；5，6-二氢-21-脱乙基-21-环丁基spinosyn A；21-脱乙基-21-异丙基spinosyn A；21-脱乙基-21-异丙基spinosyn D；21-脱乙基-21-仲丁基spinosyn A；21-脱乙基-21-仲丁基spinosyn D；21-脱乙基-21-甲基环丙基spinosyn A；21-脱乙基-21-甲基环丙基spinosyn D；21-脱乙基-21-(3-呋喃基)spinosyn A；21-脱乙基-21-(3-呋喃基)spinosyn D；21-脱乙基-21-环丙基spinosyn A 17-假糖苷配基；21-脱乙基-21-环丙基spinosyn D 17-假糖苷配基；21-脱乙基-21-环丁基spinosyn A 17-假糖苷配基；21-脱乙基-21-环丁基spinosyn D 17-假糖苷配基；16-脱甲基spinosyn D；16-脱甲基spinosyn D 17-假糖苷配基；21-脱乙基-21-正丙基spinosyn A；6-乙基spinosyn A；6-乙基-21-脱乙基-21-正丙基spinosyn A；16-脱甲基-16-乙基spinosyn A；16-脱甲基-16-乙基spinosyn D；和21-脱乙基-21-正丙基spinosyn D。
8.能够在刺糖多孢菌中起作用而产生生物活性spinosyn的杂化spinosyn聚酮合酶，所述杂化聚酮合酶包含与多个刺糖多孢菌延伸模块可操作相连的异源装载模块。
9.权利要求8的杂化spinosyn聚酮合酶，包含SEQ ID NO8的装载模块。
10.权利要求8的杂化spinosyn聚酮合酶，包含SEQ ID NO11的装载模块。
11.能够在刺糖多孢菌中起作用而产生生物活性16-乙基spinosyn化合物的杂化spinosyn聚酮合酶，所述杂化聚酮合酶是由spinosyn生物合成DNA产生的产物，该DNA已经被修饰使得spinosynPKS中模块3的AT结构域的DNA被正常整合乙基丙二酰-CoA的AT结构域的DNA取代。
12.能够在刺糖多孢菌中起作用而产生生物活性18-乙基spinosyn化合物的杂化spinosyn聚酮合酶，所述杂化聚酮合酶是由spinosyn生物合成DNA产生的产物，该DNA已经被修饰使得spinosynPKS中模块2的AT结构域的DNA被正常整合乙基丙二酰-CoA的AT结构域的DNA取代。
13.能够在刺糖多孢菌中起作用而产生生物活性2 0-乙基spinosyn化合物的杂化spinosyn聚酮合酶，所述杂化聚酮合酶是由spinosyn生物合成DNA产生的产物，该DNA已经被修饰使得spinosynPKS中模块1的AT结构域的DNA被正常整合乙基丙二酰-CoA的AT结构域的DNA取代。
14.权利要求11至13任一项的杂化spinosyn聚酮合酶，其中所述正常整合乙基丙二酰-CoA的AT结构域是泰洛星PKS的模块5的AT结构域。
15.权利要求14的杂化spinosyn聚酮合酶，其中所述AT结构域由SEQ ID NO26的DNA编码。
16.能够在刺糖多孢菌中起作用而产生生物活性18-甲基spinosyn化合物的杂化spinosyn聚酮合酶，所述杂化聚酮合酶是由spinosyn生物合成DNA产生的产物，该DNA已经被修饰使得spinosynPKS中模块2的AT结构域的DNA被正常整合甲基丙二酰-CoA的AT结构域的DNA取代。
17.能够在刺糖多孢菌中起作用而产生生物活性20-甲基spinosyn化合物的杂化spinosyn聚酮合酶，所述杂化聚酮合酶是由spinosyn生物合成DNA产生的产物，该DNA已经被修饰使得spinosynPKS中模块1的AT结构域的DNA被正常整合甲基丙二酰-CoA的AT结构域的DNA取代。
18.编码权利要求8-17任一项的杂化spinosyn聚酮合酶的DNA。
19.包含权利要求18的DNA的载体。
20.包含权利要求19的DNA的宿主生物。
21.制备6-乙基spinosyn化合物、21-脱乙基-21-正丙基spinosyn化合物或6-乙基-21-脱乙基-21-正丙基spinosyn化合物的方法，它包括培养共表达巴豆酰-CoA还原酶与spinosyn生物合成途径的宿主生物。
22.权利要求21的方法，其中宿主生物是已经被编码肉桂链霉菌巴豆酰-CoA还原酶的DNA转化的刺糖多孢菌菌株。
23.已经被编码肉桂链霉菌巴豆酰-CoA还原酶的DNA转化的刺糖多孢菌菌株。
24.选自NRRL 30539、NRRL 30540、NRRL 30541和NRRL 30542的刺糖多孢菌的生物纯培养物。
25.一种控制害虫的方法，它包括给害虫递送有效量的权利要求1的化合物。
26.包含有效量权利要求1的化合物作为活性成分与适当稀释剂或载体组合的杀虫剂组合物。
全文摘要
本发明提供了生物活性的spinosyn，能够在刺糖多孢菌中起作用而产生spinosyn的杂化spinosyn聚酮合酶，和使用该spinosyn控制昆虫的方法。
文档编号A01N45/00GK1633237SQ03804162
公开日2005年6月29日 申请日期2003年2月19日 优先权日2002年2月19日
发明者L·S·伯恩斯, P·R·格劳普纳, P·卢尔, C·J·马丁, W·A·沃斯登, C·沃尔德隆, B·威尔金森 申请人:道农业科学公司