专利名称：苯并间二氧杂环戊烯衍生物作为植物中蛋白水解活性的调节剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及苯并间二氧杂环戊烯衍生物改变植物中酶活性的用途。
背景技术：
胡椒基丁醚是一种苯并间二氧杂环戊烯聚氧乙烯，已知其有时可作为杀虫剂例如除虫菊酯、拟除虫菊酯和拟除虫菊酯类杀虫剂的增效剂。
胡椒基丁醚对人和动物的毒性较低且其具有对广谱杀虫剂的显著作用，因此得以在农业中迅速推广使用。
尽管一次又一次针对在其所增效的杀虫剂分子的灭活和分解代谢中涉及的某些特定酶的直接或间接调节作用，该增效作用的核心机制尚未阐明，例如存在于昆虫匀浆中的非特异性酯酶(胡椒基丁醚“Theinsecticide Synergist”，1998，Academic Press，p.215)，更近期地对微粒体氧化酶(Alzogaray R.A.Arch.Insect Biochem.Physiol.，2001，46119-126)，或对细胞色素P450单加氧酶(Kotze等，Int.J.Parasitol，1997，2733-40)。然而，迄今为止尚未报道PBO对植物源性酶的作用，更没有具体关于对蛋白水解酶或肽酶类酶作用的报道。
蛋白酶和其生理抑制剂作为在动物界和植物界中的细胞进程调节中关键酶的重要性已为公众所知并得到广泛的认可。
例如，植物中蛋白水解酶和天然抑制剂间的平衡是休眠种子发芽过程的精确时序调节的核心。
已知在进化过程中，植物选择合成蛋白水解酶的天然抑制剂(除其它因素外)作为抵御寄生虫的保护机制。例如Harsulkar A.M.等(PlantPhysiol.，1999，121497-506)已经证实了基于该类途径的干预的有效性。EP 502730和EP 339009中描述了基于使用转基因表达的蛋白酶抑制剂的方法首先抑制剂的表达足以确立抵御线虫的保护作用，其次，天然蛋白酶抑制剂的转基因表达加强编码Bt毒素(苏芸金杆菌毒素)的最初基因的产物的杀虫剂作用。S.Macintosh等(J.Agric.FoodChem.1990，381145-1152)描述了相同的方法。
因此，很明显具有植物源性蛋白水解酶的可调节的活性的产品的实用性对于广泛的应用领域具有高度的工业价值。
发明概述本发明的目的是式I的苯并间二氧杂环戊烯衍生物，优选胡椒基丁醚(PBO)作为植物中蛋白水解酶活性或含量调节剂的用途。能够水解肽键的蛋白水解酶优选自羧肽酶、氨肽酶、二肽酶、内肽酶。
用苯并间二氧杂环戊烯衍生物处理植物，优选用具有杀昆虫功能的蛋白，优选属于苏芸金杆菌毒素(Bt-毒素)类，属于Cry族的蛋白进行转基因的植物。
所述转基因植物优选为棉花、玉米、番茄、马铃薯和大豆，或更优选为棉花。
本发明的另一方面涉及含有苯并间二氧杂环戊烯衍生物的组合物作为活性成份与适用的乳化剂和可选地与选自苯并三唑、二苯甲酮和空间位阻胺的光保护化合物联合作为植物中蛋白水解酶活性或含量调节剂的用途。
本发明另一方面涉及调节植物，优选转基因植物，更优选棉花、玉米、番茄、大豆、马铃薯中蛋白水解活性的方法，基本上包括用苯并间二氧杂环戊烯衍生物和含有所述化合物的组合物，以终浓度包含50～500克/公顷的PBO并在生长周期末施用的方式处理所述植物。
图1.显示了用Dixon图确定浓度渐增的PBO对木瓜蛋白酶活性的抑制。
从获自分别以1.5×10-4M(实心圆-●-)和6×10-5M(空心圆-○-)使用的两种不同底物浓度(CBZL赖氨酸-对-硝基苯基酯)的Dixon图中，可以计算出PBO对木瓜蛋白酶的抑制常数(Ki)，等于2.6×10-3M。此外，从图中可以计算出IC50等于2×10-3M。
横坐标PBO浓度(M)；纵坐标1/V(ΔAbs/分钟)。ISO-AOT50mM反胶束法(Reverse micelles assay)(AOT双倍喷雾(doubleaerosol)(2-乙基己基磺基琥珀酸钠于异辛烷(ISO)中)；Wo(H2O/AOT)＝23图2.显示了用Dixon图确定浓度渐增的PBO对无花果蛋白酶活性的抑制。
从获自分别以1.5×10-4M(实心园-●-)和6×10-5M(空心园-○-)使用的两种不同底物浓度(CBZL赖氨酸-对-硝基苯基酯)的Dixon图中，可以计算出PBO对无花果蛋白酶的抑制常数(Ki)，等于0.45×10-3M。此外，从图中可以计算出IC50等于0.8×10-3M。
横坐标PBO浓度(M)，纵坐标1/V(ΔAbs/分钟)。ISO-AOT50mM反胶束法(AOT双喷雾(twin aerosol)(磺基琥珀酸钠2-乙基己基酯于异辛烷(ISO)中)；Wo(H2O/AOT)＝25图3.显示了用Dixon图确定浓度渐增的PBO对波萝蛋白酶活性的抑制。
从获自分别以1.5×10-4M(实心园-●-)和6×10-5M(空心园-○-)使用的两种不同底物浓度(CBZL赖氨酸-对-硝基苯基酯)的Dixon图中，可以计算出PBO对波萝蛋白酶的抑制常数(Ki)，等于0.1×10-3M。此外，从图中可以计算出IC50等于0.4×10-3M。
横坐标PBO浓度(M)，纵坐标1/V(ΔAbs/分钟)。ISO-AOT50mM反胶束法(AOT双喷雾(磺基琥珀酸钠2-乙基己基酯于异辛烷(ISO)中)；Wo(H2O/AOT)＝28图4.发芽4日后棉花芽中的羧肽酶活性。
通过在用TCA沉淀蛋白并离心分离后于石英比色杯中确定280nm吸光度测定将丙酮粉末在pH6.5水性缓冲液中混悬后30′，60′，90′和120′时棉花芽中蛋白水解活性程度。
每组分析按一式两份实施。采用每组分析的平均值比较处理的和未处理的样品中的羧肽酶活性值。
处理的样品深灰未处理的样品浅灰图5.发芽4日后棉花芽中的内肽酶活性。
通过在用TCA沉淀蛋白并离心分离后于石英比色杯中确定280nm吸光度测定将丙酮粉末在pH7.7水性缓冲液中溶解后15′，30′，60′，90′和120′时棉花芽中水解活性程度。
每组分析按一式两份实施。采用每组分析的平均值比较处理的(深灰色)和未处理的(浅灰色)样品中的羧肽酶活性值。横坐标时间(分钟)；纵坐标Abs 280nm。
图6.经PBO处理的对比未经PBO处理的棉花植物中的Bt含量。
采用免疫酶测定法确定植物发育不同阶段的Bt水平。
a)检测的Bt毒素值；纵坐标以ppm表示的Bt；横坐标植物培育天数和不同植物组织。黑色未处理的棉花；灰色PBO处理的棉花。还显示了标准差。
b)在生长期间，PBO处理的对比未处理的植物中Bt含量的差异百分数。纵坐标PBO处理的植物中的Bt含量百分数(ppm)减去未处理植物中的含量；横坐标植物培育天数和不同植物组织(子叶或叶)。
图7.通过辐射扩散实验(Radial Diffusion Assay)比较不同的生长阶段的PBO处理的和未处理的棉花植物的内肽酶活性。
将由植物提取物产生的亮区(clear zone)半径与获自胰蛋白酶连续稀释的标准曲线比较。将胰蛋白酶标准溶液用于绘制每一样品板的标准曲线，由此以胰蛋白酶等效物单位表示内肽酶活性。对每一提取物，采用Biuret法测定可溶蛋白的量(mg)，然后以特异性活性即单位/可溶蛋白mg表示酶活性。横坐标时间(天)；纵坐标胰蛋白酶单位/可溶蛋白mg。
图8.通过采用DL-BAPA作为底物的光度测定法比较PBO处理的和未处理的棉花植物间的肽酶活性(U/可溶蛋白mg)。
DL-BAPA水解后于410nm实施光度测定。以能够于pH8.2和30℃以410nm/分钟产生一单位吸光度变量的酶量定义一个肽酶单位(U)。
对每一提取物，采用Biuret法测定可溶蛋白的量(mg)，然后以特异性活性即单位/可溶蛋白mg表示酶活性。
每一分析均按一式两份或一式三份实施，还显示了每个点的标准差。横坐标时间(天)；纵坐标胰蛋白酶单位/可溶蛋白mg。
发明详述本发明涉及如下通式I所含的苯并间二氧杂环戊烯衍生物的用途 其中R1、R2和R3是相同或不同地选自氢、C2-C8烷基；CH2OR4，其中R4选自氢、-(CH2CH2O)n-R5，其中n为1～4的整数且R5选自氢、C1-C8烷基、无取代基的或由C1-C4烷基、卤素、氰基基团(CN)、-SO3H基团、羧基烷基团-COOR6(其中R6为氢或C1-C8烷基)或-N(R7)-R8基团取代的芳基，其中R7和R8相同或不同地为氢或C1-C4烷基或与其结合的氮原子一起代表哌啶基、吡咯烷基、吗啉基基团；另外R5选自无取代基的或在芳环上由选自C1-C4烷基、卤素、氰基基团、-SO3H基团、羧基烷基团-COOR9的取代基取代的C7-C9芳烷基，其中R9定义同R6且R1、R2和R3不同时为氢，所述使用基于如下惊人的发现，前述定义的化合物具有调节植物蛋白水解酶活性或含量的能力。
优选地，在上述化合物中，R1、R2和R3取代基相同或不同地选自氢、C2-C4烷基、CH2OR4，其中R4选自氢、-(CH2CH2O)n-R5，其中n为1～2的整数且R5选自氢、C1-C4烷基、苄基、无取代基的或由C1-C3烷基取代的芳基，且R1、R2和R3不同时为氢。
更优选地，在式I的所述化合物中，R1、R2和R3取代基相同或不同地选自氢、丙基、CH2OR4，其中R4为-(CH2CH2O)2-R5，R5选自C2-C4烷基、苯基、甲苯基，且R1、R2和R3不同时为氢。更优选与式(II)的胡椒基丁醚(PBO)或5-[[2-(2-丁氧基乙氧基)乙氧基]甲基]-6-丙基-1，3-苯并间二氧杂环戊烯相应的化合物 我们将在下文中为简称提供参考，仅对于已知缩写为PBO的胡椒基丁醚化合物或术语“苯并间二氧杂环戊烯衍生物”，应该认为在本申请中使用该缩写词和该术语意指通式I的全部化合物，包括优选的取代基。
出于本发明目的，术语蛋白酶、蛋白水解酶或肽酶以等效形式使用且意指肽水解酶(在本说明书中将其简称为蛋白水解酶或蛋白酶)，即指具有对肽或不依赖其位置的酰胺键(故其或者位于多肽链内，或者位于N-或C-末端终点)水解活性的酶。
因此根据该定义，内肽酶类酶和外肽酶，如水解肽键从N-或C-端连续释放单个氨基酸的氨肽酶或羧肽酶均包含于蛋白水解酶的定义中。
活性能被PBO调节的蛋白水解酶，优选羧肽酶、氨肽酶、二肽酶、内肽酶，其中内肽酶优选丝氨酸蛋白酶，胱氨酸蛋白酶、组织蛋白酶，金属-内肽酶；胱氨酸蛋白酶优选波萝蛋白酶、钙蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶。
与昆虫和病原微生物的蛋白酶相比，植物中蛋白水解活性的调节(例如通过活化特异性抑制剂)具有主要的抵御作用。在由机械或生物方式产生损伤的情况下，由于植物的防御策略而新合成蛋白酶抑制剂。
抑制剂对内源蛋白酶的调节潜能在种子中可能是适度的并在发芽期间趋于消失；重要作用要归功于抑制剂在种子成熟期间防止蛋白在累积阶段的降解。因此根据其它目的，本发明包括PBO对种子蛋白水解调节活性的其它实施方案；根据其它实施方案，PBO还可用于确定在创伤或损伤的情况下能调节一般组织生长的植物防御途径的活性。
本说明书所描述的针对植物细胞蛋白水解活性的新活性的其它优势在于调节生成、成熟或降解，或换句话说内源性蛋白样物质的翻转(turn-over)，所述蛋白样物质例如是那些具有天然杀虫剂或杀真菌剂功能或具有组织修复功能的物质。该机制可有助于加强植物细胞对可能的寄生侵袭或对外源压力的天然反应。
Leah等(J.Biol.Chem.，1991，2661564-1573)公开了具有杀真菌活性的物质的实例以及此处未充分描述的核糖体灭活蛋白(Ribosome Inactivating Proteins(RIP))，该蛋白具有仅针对远相关性核糖体(如真菌)的特异性，而不针对植物核糖体，或壳多糖酶和(1-3)-β-葡聚糖酶，其能阻碍真菌细胞壁的合成。由植物产生的，具有无活性蛋白前体形式且其成熟型具有抵抗细菌和真菌功能的其它物质为硫堇，其已被描述于例如Bohlmann H.Critical Reviews inPlant Sciences，1994，131-16中。
本领域技术人员可根据已知方法将根据此处所描述的新用途的PBO处理通过集中在植物暴露于空气中的区域，特别是在叶片上而实施于所有植物类型。还可以对种子进行所述处理。在其优选实施方案中，所述处理优选实施于选自棉花、玉米、番茄、马铃薯和大豆的转基因植物。根据该优选实施方案，本发明涉及苯并间二氧杂环戊烯衍生物在插入了编码蛋白转基因的转基因植物中作为具有蛋白水解活性调节剂的用途。
在用PBO处理后，植物蛋白水解活性发生变化，该变化具有依赖于被认为能够增加或甚至减少蛋白的有效性或蛋白的活性形式的系统而不同的效果。已知，稳态水平是蛋白降解和生成比率的结果。然而，蛋白水解作用已知还是蛋白活化的机制。结果，所述新用途能够增加植物对寄生虫感染或外部侵袭的天然或人工抵抗力。因此，本发明另一且优选的实施方案是通过调节植物细胞中蛋白水解活性来调节转基因表达蛋白的水平。特别优选用一种苏芸金杆菌毒素转基因的植物。
特别地，在用苏芸金杆菌Bt毒素基因转基因植物的情况下，控制蛋白水解作用机制的可能性对控制转基因毒素的活性或调节其生成都是非常重要的。
然而，应当注意的是本发明的该优选实施方案不限于对转基因蛋白的单一的生成或活化机制，而可以延伸至通过对蛋白水解酶直接或间接作用(如通过蛋白酶抑制剂)而由PBO活化的所有机制。可通过直接或间接测定法监测蛋白水解酶水平的增加。
在间接测定法中，可根据本领域众所周知的方法检测蛋白酶对各种内源或外源底物的活性。
在转基因植物的情况下，转基因编码一种苏芸金杆菌的Cry蛋白而更优选编码选自CryI，Cry II，Cry III，Cry IV，更特别为CryIA(a)，(b)或(c)的蛋白。
根据特别优选的实施方案，植物为棉花且转基因编码苏芸金杆菌CryI毒素。
本发明人还观察到在Bt Cry I蛋白转基因的棉花中，PBO处理后转基因毒素的量高于未处理的转基因植物，该发现与在至少100天期间内PBO-处理的植物对比未处理的植物前者蛋白水解活性的丢失相关。
因此式I的苯并间二氧杂环戊烯衍生物作为蛋白水解调节剂的用途特别有益于在优选自棉花、玉米、番茄、马铃薯或大豆的转基因植物(优选当其用Bt-毒素转基因时，更优选用Cry I毒素转基因时)中抑制蛋白水解机制而直接或间接改变植物细胞中转基因Bt毒素的表达(即灭活或减少)。特别优选用PBO处理以一种苏芸金杆菌毒素转基因的棉花。
按本领域已知方法，例如采用Bt毒素特异性抗体实施的免疫酶测定法检测植物中的Bt毒素水平。
可选地，通过直接检测田间或实验室中寄生昆虫死亡率的缺少可以估计低于可用极限的Bt毒素量。
根据另一实施方案，本发明提供了调节植物中蛋白水解活性，优选至少部分抑制植物的蛋白水解活性的方法，包括基本上用PBO或其衍生物或用含有PBO做为活性成分的组合物，以包括50～800克/公顷，更优选100～400克/公顷，特别优选200～350克/公顷的活性成分浓度处理植物。根据本发明的方法，优选在每个生长周期重复三次处理，更优选在生长周期结束时实施处理。
该优选方面在植物为转基因性且更特别当所述棉花、玉米、番茄、马铃薯和大豆用苏芸金杆菌Cry毒素转基因时为特别适当的。事实上在处理后数小时至数天，在植物生长周期的不同阶段可观察到PBO的调节剂活性。
PBO对植物中蛋白酶活性的调节优选为通过PBO对酶的直接抑制，或通过间接作用如，通过蛋白酶-抑制剂的活化或特异性蛋白酶抑制剂的新合成的负向调节。
采用含有适宜赋形剂或乳化剂的组合物可以方便地实施PBO处理。因此，根据另一目的，本发明涉及含有式I的苯并间二氧杂环戊烯衍生物的组合物作为活性成分，或其优选实施方案，如PBO，联合适用的乳化剂或赋形剂和可选的光保护剂化合物，作为植物中蛋白水解酶活性或含量调节剂的用途。所使用的乳化剂选自烷基芳基磺酸钙盐、脂肪酸聚乙二醇酯、烷基芳基聚乙二醇醚、脂肪醇聚乙二醇醚、环氧乙烷-环氧丙烷缩合物、烷基聚醚、山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐酯。所述乳化剂特别优选自烷基芳基聚乙二醇醚和烷基芳基磺酸钙盐。
所述乳化剂以2％(w/w)的最低浓度存在。
含有乳化剂或赋形剂组合物中的PBO浓度包括1～98％(w/w)，优选20～95％，更优选50～90％。
为了此处目的，将活性成份联合适宜的赋形剂或乳化剂的混合物命名为“浓缩物”。在浓缩物中，可选地加入抵抗光氧化的保护剂(光保护剂)，所述保护剂选自包含苯并三唑、二苯甲酮和空间位阻胺的化合物类，其浓度包含以浓缩物的重量比0.1％～10％，优选0.5％～8％，更优选1％～5％。
在苯并三唑中，化合物选自2-(2′-羟基-5-叔辛基苯基)苯并三唑和2-(2′-羟基-3′，5′-二叔丁基苯基)5-氯苯并三唑。
在二苯甲酮中，化合物选自2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮，2-羟基-4-辛基氧基二苯甲酮，2′-二羟基-4，4′-二甲氧基二苯甲酮。
在空间位阻胺中，化合物选自癸二酸二(2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基)酯；癸二酸二(1，2，2，6，6-五甲基-4-哌啶基)酯；α-[[6-[[4，6-二(二丁基氨基)-1，3，5-三嗪-2-基](2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基)氨基]己基](2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基)氨基]-Ω-[4，6-二(二丁基氨基)-1，3，5-三嗪-2-基]-聚[[6-[丁基(2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基)氨基]-1，3，5-三嗪-2，4-二基][2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基)亚胺基]-1，6-己醛二基[2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基)亚胺基]；琥珀酸二甲酯与4-羟基-2，2，6，6-四甲基-1-哌啶乙醇的聚合物；N，N′二(2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基)-1，6-己二胺与2，4，6三氯-1，3，5-三嗪和1，1，3，3-四甲基丁胺的聚合物；聚-甲基丙基-3-氧(4((2，2，6，6-四甲基)哌啶基硅氧烷；1，3，5-三嗪-2，4，6，-三胺，N，N[1，2-乙烷二基二[[[4，6-二[丁基(1，2，2，6，6-五甲基-4-哌啶基)氨基]-1，3，5-三嗪-2-i1]亚胺基]-3，1-桥亚丙基二基]]-二[N′，N″-二丁基-N′，N″-二(1，2，2，6，6-五甲基-4-哌啶基)]或下述混合物琥珀酸二甲酯与4-羟基-2，2，6，6-四甲基-1-哌啶乙醇的聚合物和N，N′二(2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基)-1，6-己二胺与2，4，6三氯-1，3，5-三嗪和1，1，3，3-四甲基丁胺的聚合物的混合物。
特别优选为二苯甲酮，更优选2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮和2-羟基-4-辛基氧基二苯甲酮，而在空间位阻胺中，优选化合物为癸二酸二(2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基)酯和癸二酸二(1，2，2，6，6-五甲基-4-哌啶基)酯。
可选地，含有光保护剂的浓缩物是可乳化的，因此其可以与水混合以便获得将进行喷雾优选经田间喷撒的适宜溶液，因此PBO的浓度包括50～800克/公顷，优选100～400克/公顷，更优选200～350克/公顷。田间每个施用周期可包括每个生长周期施用1次至3次。
通过下述非限制性实施例更好地描述本发明。
具体实施例方式
实施例1 胡椒基丁醚对半胱氨酸内肽酶的体外抑制在分散于有机溶剂中的反胶束法中实施检测，Walde等已描述了所述反胶束法(Eur.J.Biochem.，1988，173401-409)，并已报道于关于用天然和人工抑制剂对胰蛋白酶抑制的动力学研究文献中。所述检测适于下述纯化的植物酶木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和波萝蛋白酶(分别位于Sigma catalogue N°P4762、F4125、B5144)，其中存在底物CBZ(L赖氨酸-对-硝基苯基酯，Sigma catalogue N°C3637)，且分别以Wo(摩尔比率水/表面活性剂或H2O/AOT)＝23，25，28实施。
现有文献中已经记载了用于胰蛋白酶的反胶束上的酶检测法，且所述酶检测法适用于不同的酶。通过在石英分光光度池中充分混合1ml含有适当体积的蛋白酶和不同缓冲溶液的50mM AOT-ISO而获得这些值，其中所述缓冲液分别是用于木瓜蛋白酶的MES(2-[N-吗啉代]乙基磺酸)、用于无花果蛋白酶的HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[2-乙基磺酸])和用于波萝蛋白酶的乙酸盐溶液。当溶液完全透明且明显均质时，将其调整为恒温30℃。在该溶液中加入适当体积的底物CBZ(溶解于乙腈/H2O，80∶20(v/v)，浓度为15mM)，然后再搅拌(溶液恢复透明)，采用Cary 219分光光度计在340nm处检测吸光度的变化(Δabs)。检测条件概括如下木瓜蛋白酶AOT-ISO50mM(二磺基琥珀酸钠2-乙基己基酯-异辛烷)-WO23-缓冲液含有2.5mM胱氨酸的50mM MES，pH6.2，-温度30℃-底物1.5×104M和6×10-5M CBZ(L赖氨酸-对-硝基苯基酯，Sigma)-木瓜蛋白酶2mg/ml-PBO(存在时)4.87×10-5M～5.9×10-3M无花果蛋白酶-AOT-ISO50mM(二磺基琥珀酸钠2-乙基己基酯-异辛烷)-Wo25-缓冲液含有2.5mM L-胱氨酸的50mM HEPES，pH7.1，-温度30℃-底物1.5×10-4M和6×10-5M CBZ(L赖氨酸-对-硝基苯基酯，Sigma)-无花果蛋白酶1.7mg/ml-PBO(存在时)4.87×10-4M～5.9×10-3M波萝蛋白酶-AOT-ISO50mM(二磺基琥珀酸钠2-乙基己基酯-异辛烷)-Wo28-缓冲液包含1mM L-胱氨酸的10mM乙酸盐，pH4.6，-温度30℃-底物1.5×10-4M和6×10-5M CBZ(L赖氨酸-对-硝基苯基酯，Sigma)-波萝蛋白酶2mg/ml-PBO(存在时)4.87×10-4M～5.9×10-3M。
以Dixon图(例如″Quantitative Problems in Biochemistry″，EA.Dawes，5thed.1972 Baltimore，The Williams和Wilkins Company所描述的)的形式在图1，2和3中图解说明得到的实验数据。所述图解说明可用于计算PBO的Ki值(抑制常数)，其分别对于木瓜蛋白酶为2.6×10-3M，对于无花果蛋白酶为4.5×10-4M和对于波萝蛋白酶为1×10-4M，因此显示了PBO对波萝蛋白酶的抑制较高。获自非饱和底物浓度下的检测结果显示了，在这些条件下，PBO抑制了所有测试的蛋白酶。从图1-3的Dixon图中特别可计算出PBO对木瓜蛋白酶系统的IC50等于2×10-3M，对无花果蛋白酶的IC50等于0.8×10-3M和对波萝蛋白酶等于0.4×10-3M。
实施例2.PBO对波萝蛋白酶的抑制。
按Heinrikson & Kezdy所述(1976，Methods in Enzymol.45，740页)实施所述检测。此处简要概括了检测条件在3ml含有KCl(0.1M)和L-胱氨酸(1mM)，pH4.6的10mM乙酸盐缓冲液中50μg波萝蛋白酶与变量的Na CBZ-L-赖氨酸-对-硝基苯基酯底物混合。通过H2O中存在1％PBO的溶液的两个不同实验中340nm吸光度/分钟的变化来检测反应初速度的变化。
结果显示于表1中。
表1.1％ PBO对波萝蛋白酶活性的影响底物浓度对照 测试1 测试2 均值(％浓度)24μM 0.0199 0.0141 0.0130 0.0136(68％)48μM 0.0297 0.0243 0.0297 0.0270(68％)96μM 0.0623 0.0518 0.0461 0.0490(78％)数据显示了1％ PBO具有对波萝蛋白酶65-80％的抑制，其中底物浓度包括20-24μM和48-50μM。
采用渐增的PBO浓度和固定的底物浓度(240μM)重复所述实验。
表2中记载了数据。
表2.PBO的渐增量对波萝蛋白酶活性的影响％ PBO试验1 试验2 试验3(W/W) 初速度(对照的百分数)00.13820.12210.10510.3340.1306(95％) 0.1197(98％) 0.10290.5 0.1252(91％) - -0.667- 0.1079(88％) -10.1194(86％) 0.1057(86％) -1.334- 0.1029(84％) -1.667- 0.0927(76％) -从表2中的数据，可观察到浓度超过0.5％的PBO具有对蛋白水解酶波萝蛋白酶的抑制。
该影响依赖于浓度。抑制程度与在先实施例中获得的数据一致。
实施例3.PBO对棉花幼苗中羧肽酶和内肽酶的影响。
在体外分析中为了评估PBO对棉花中内源植物酶系统的作用，使用获自经处理的(PBO)和未处理的冻干种芽的丙酮粉末在不加任何特异性外源底物时进行检测。基本思想是“冷冻”生理性蛋白水解酶活性然后通过将蛋白水解酶系统在适宜缓冲液中简单溶解来重建该过程(所述适宜缓冲液为0.1M磷酸缓冲液pH6.5和0.1M tris-HCl pH7.7)，采用根据Hile等(1972)；Funkhouser等(1980)所描述的方法来评估羧肽酶和内肽酶活性。
材料和方法棉花种子(cv.Carmela)获自“Semillas Battle”，Barcelona(E)。
发芽条件先用自来水漂洗种子，然后种子在蒸馏水中通风下过夜吸水(Funkhouser，E.A.等，Z.Pflanzenphysiol.，1980，100，319-324)。
在该步骤后，将种子种植于固定的且灭菌的沙土中，然后用蒸馏水(未处理的种子)和等体积PBO饱和微悬浮液(1％w/v)(处理的种子)进行浇灌。按Hile，J.N.和Dure，L.S.所述(J.Biol.Chem.，1972，2475034-5040)，用塑料膜覆盖含有种子的塑料箱并置于发芽器中，置于黑暗中，30℃，4天。
冻干收集4天棉花芽并冷冻于液氮中冻干(Hile等1972)。在该步骤后，用研钵将材料研碎使其不含纤维物质并沉积以获得约0.5筛目的非常均质的粗粉。
丙酮粉末的制备采用正己烷(1∶10 w/v)于室温下将所述粉脱脂，然后用丙酮于-20℃下处理以除去色素和聚酚类化合物，此时主要是棉酚。将得到的粉末于室温下保存于干箱中。
羧肽酶测定将丙酮粉末(30mg)悬浮于缓冲液(4ml)中并在37℃下孵育30、60、90、120分钟。加入1ml 12％三氯乙酸终止蛋白水解作用。此时，使用的缓冲液为0.1M磷酸缓冲液，pH6.5(Hile等1972)。对照为用相同方法制备但立即通过加入1ml三氯乙酸灭活的相同样品的悬浮液。同时实施经处理的和未处理的样品的实验。
光度分析用三氯乙酸沉淀蛋白，然后过滤分离，使用Whatman滤纸n.4，然后进行微滤(Orange Scientific Braine I’Alleud，Belgium(0.2μm))。最后，通过在石英比色杯中检测280nm吸光度分析水解蛋白样品澄清溶液。
每组分析均实施两次。使用每组分析的均值比较处理的和未处理的样品的羧肽酶活性值。
从图.4中所示数据可推断出与处理的样品中羧肽酶相关的蛋白水解活性低于未处理的样品。
表3中还记载了这些差异的百分数。
表3.处理的和未处理的棉花芽发芽第4天时羧肽酶活性。
内肽酶的检测在缓冲液(4ml)中混悬丙酮粉末(30mg)，然后于37℃孵育15′、30、60、90、120分钟。加入1ml 12％三氯乙酸终止蛋白水解作用。此时所使用的缓冲液为0.1M磷酸盐pH7.7(Funkhouser等1980)。对照组是用相同方法制备但立即通过加入1ml三氯乙酸进行灭活的相同样品的悬液。同时实施处理的和未处理的样品的实验。
光度分析用三氯乙酸沉淀蛋白，然后过滤分离，使用Whatman滤纸n.4，然后进行微滤(Orange Scientific Braine I’Alleud，Belgium(0.2μm))。最后，通过在石英比色杯中检测280nm吸光度分析水解蛋白样品澄清溶液。
每组分析均实施三次。使用每组分析的均值比较处理的和未处理的样品的羧肽酶活性值。如图.5中所示，用PBO处理的棉花芽中内肽酶活性低于未处理的样品。在表4中还记载了这些差异的百分数。
表4.PBO处理的和未处理的棉花芽发芽第4天时内肽酶活性。
实施例4.PBO对转基因棉花植物样品中Bt-毒素含量的影响。
为了研究Bt毒素水平和PBO处理对棉花植物作用间的相关性，在用PBO处理的或未处理的(对照)Bt转基因的棉花植物样品(cv.SicalaV2i)中检测Bt毒素浓度。
对在植物不同发育期播种后4，35，60，85日收集的样品实施检测。
材料和方法为确定PBO处理的或未处理的棉花样品中的Bt毒素浓度，采用特异性ELISA测定法。ELISA Cry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒获自Envirologix(Portland，Maine-USA)。按照包括如下改变的Envirologix操作规程实施所述检测1.使用得自叶或子叶组织的棉花冻干粉末替代新鲜和完整的叶组织。
2.从棉花冻干粉中提取Bt毒素，样品/缓冲液比率为1∶25(w/v)。
3.采用将样品置于缓冲液中于室温下至少4小时进行提取替代采用Envirologix Disposable Tissue Extractor。然后以5,000×g，室温离心5分钟澄清提取物。
图6a显示了在上述植物发育期时PBO处理的或未处理的棉花植物样品中Bt浓度。在图6和表5中还显示了在种植后35、60、85天时PBO-处理的样品中Bt含量显著降低，而在4天时没有发现显著差异。图6b显示了PBO-处理的或未处理的棉花植物样品间的差异百分数。
表5中概括了用所述检测法获得的结果。
表5.用PBO处理的和未处理的转基因棉花样品中Bt含量以及二者间的差异
Δ处理组数值减去对照组数值(未处理的cv V2i)的差值实施例5.PBO处理对不同生长期棉花植物中蛋白酶(内切蛋白酶)活性的影响为了评估PBO对棉花植物中蛋白水解活性的作用，检测PBO处理的和未处理的棉花叶(作为对照)样品的酶活性。所述样品是在植物的不同发育期播种后4，35，60和85日收集的。
对这些样品还进行了检测Bt含量(如实施例4中所述)的分析。为实现该目的，采用两种不同的检测法检测粗冻干叶提取物的酶活性，所述检测法为辐射扩散实验(RDA)，其中蛋白例如牛明胶，用作检测内肽酶活性的底物；以及描述于下一实施例中的光度法，其中DL-BAPA用作确定一般肽酶活性的底物。
材料和方法植物栽培预先在蒸馏水中漂洗cv.Sicala V2i品种的棉花种子，然后置于等数量的含有固定的且灭菌的沙土的适宜塑料箱中。用等体积的蒸馏水浇灌种子然后用塑料膜覆盖培养箱以避免在黑暗中30℃4天进行发芽时的水份蒸发。发芽4日后将欲分析的种子用蒸馏水或用等体积PBO饱和的微悬浮液(2％ W/V)浇灌。4日后，收集这些幼芽进行分析，而将其他幼芽移至适宜的盆中并置于日间温度为24℃，夜间温度为20℃的温室中。
处理于播种后固定时间4，35，60，85日，用2％(w/v)商业PBO剂型(Endura)处理高度基本相同的10株植物。
通过在植物上蒸发稀释的试剂(小心处理叶片的两侧)实施处理。
冻干每一处理后2天，收集处理的植物样品和相应对照，将全部叶子冷冻于液氮中冻干。在该步骤后，在研钵中将所述物质磨为粉末，然后于室温下保存与干箱中。
制备提取物用两个步骤提取处理样品和对照样品的一等份粉末(表示植物生长的每个步骤)。对粉末样品的提取采用0.1M Tris-HCl，pH7.7(1∶20 w/v)缓冲液并使用Ultraturrax搅拌器以24,000×RPM搅拌2分钟，于冰浴中操作以避免过热。通过5,000×g于10℃，离心20分钟使提取物澄清。收集上清然后使用Whatman纸n°4过滤。用相同的步骤进一步提取片状沉淀物，不同的是提取比率为1∶10(w/v)。最后，将两个提取步骤的上清合并，然后采用适宜的浓缩仪(Amicon Inc.Beverly，MA-USA)以3,000×g于15℃离心2小时将其浓缩4-5倍，符合10KD分级的膜。
蛋白浓度对每一提取物，采用Biuret法测定可溶蛋白的量然后以特异性活性即单位/mg可溶蛋白表示酶活性。
按照Santarius，K.和Ryan，C.(Anal.Biochem.，1977，771-9)的描述在Petri dishes培养皿中实施RDA，所述Petri dishes培养皿中含有分散于琼脂糖凝胶中作为底物的牛明胶。每一培养皿均含有5个孔，其中在4个孔中注满浓缩棉花提取物的适宜等份，而在1个孔中注满牛β-胰蛋白酶作为标准溶液(0.2U/ml)。用塑料膜覆盖并密封培养皿以避免水份蒸发，然后于37℃孵育16小时。
由于在不透明背景上的牛明胶蛋白水解作用，蛋白-琼脂糖凝胶中的酶活性在每个圆形孔周围形成清晰的放射状扩散区。
通过测量由植物提取物产生的亮区(clear zone)的半径来计算胰蛋白酶等效物并将其与获自胰蛋白酶连续稀释的标准曲线比较。每个培养皿中均含有胰蛋白酶的标准溶液，其用于绘制每个平板的标准曲线，因此以胰蛋白酶等效物的单位表示内肽酶活性。
每组分析均按一式四份实施。图7显示了获自处理的或未处理的棉花样品RDA的内肽酶活性值。该实验显示出商业PBO剂型(Endura)，特别是于播种后35、60、85日时，显著抑制Sicala V2i基因型的棉花叶中内肽酶活性。表6中显示了处理的或未处理的棉花样品间的差异百分数。
表6.用RDA法测定PBO的内肽酶活性处理的和未处理的样品。
U＝胰蛋白酶等效物按照Erlanger，B.F.等(Arch.Biochem.，1961，95271-278)的描述实施光度法。由于DL-BAPA水解，故可在该试验中于410nm处检测吸光度变量。在比色杯中将20μl棉花粗提取物与980μl DL-BAPA于缓冲液0.1M Tris-HCl，pH8.2中直接混合实施所述检测。以能够于pH8.2和30℃以410nm/分钟产生一单位吸光度变量的酶量确定一个肽酶单位。
每组分析均按一式两份或一式三份实施。图8显示了以U/可溶蛋白mg计算PBO处理的或未处理的棉花样品中的肽酶活性值。该图中显示了肽酶活性在发育约60天时为最大值。此时，用商业PBO剂型(Endura)的处理显示了对Sicala V2i棉花蛋白水解活性的最显著抑制。通过PBO处理对比未处理的棉花植物中的该测定在整个植物生长期中均观察到蛋白水解活性的差异。在植物生长期的大部分时期观察到了统计学意义上的抑制。最后，表7中显示了处理的或未处理的Sicala V2i棉花样品的肽酶的特异性活性。
在该表中，还记载了处理的和未处理的样品间的活性差异百分数。
表7.以DL-BAPA为底物的光度检测PBO处理的和未处理的样品的肽酶活性(U/溶蛋白的mg)。
权利要求
1.具有式I的苯并间二氧杂环戊烯衍生物作为调节植物中蛋白水解酶的活性或含量的用途， 其中R1、R2和R3相同或不同地选自氢、C2-C8烷基、CH2OR4，其中R4选自氢、-(CH2CH2O)n-R5，其中n为1～4的整数，且R5选自氢、C1-C8烷基、无取代基的或由C1-C4烷基、卤素、氰基(CN)基团、-SO3H基团、羧基烷基性-COOR6基团取代的芳基，其中R6为氢或C1-C8烷基、-N(R7)-R8基团，其中R7和R8相同或不同地为氢或C1-C4烷基或与其结合的氮原子一起可代表哌啶基、吡咯烷基、吗啉基基团，R5另外选自无取代基或在芳环上由选自C1-C4烷基、卤素、氰基基团、-SO3H基团、羧基烷基性基团-COOR9的取代基取代的C7-C9芳烷基，其中R9定义同R6，且在R1、R2和R3全部相同时，其从不为氢。
2.根据权利要求1的用途，其中R1、R2和R3相同或不同地选自氢、C2-C4烷基、CH2OR4，其中R4选自氢、-(CH2CH2O)n-R5，其中n为1～2的整数，R5选自氢、C1-C4烷基、苄基、无取代基的或C1-C3烷基取代的芳基。
3.根据权利要求2的用途，其中R1、R2相同或不同地选自氢、丙基、CH2OR4，其中R4为-(CH2CH2O)2-R5，R5选自C2-C4烷基、苯基、甲苯基。
4.根据权利要求3的用途，其中所述化合物具有如下式II
5.根据权利要求1-4任一项的用途，其中所述酶选自羧肽酶、氨肽酶、二肽酶、内肽酶。
6.根据权利要求5的用途，其中所述内肽酶选自丝氨酸蛋白酶，胱氨酸蛋白酶、组织蛋白酶，金属-内肽酶。
7.根据权利要求6的用途，其中所述胱氨酸蛋白酶为波萝蛋白酶、钙蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶。
8.根据权利要求1-7任一项的用途，其中所述植物选自大豆、玉米和棉花。
9.根据权利要求8的用途，其中所述植物为转基因性的。
10.根据权利要求9的用途，其中所述转基因编码苏芸金杆菌Cry蛋白。
11.根据权利要求10的用途，其中所述Cry蛋白选自Cry I、CryII、Cry III、Cry IV。
12.根据权利要求11的用途，其中所述蛋白为(a)、(b)或(c)亚型的Cry IA蛋白。
13.根据权利要求1-7任一项的用途，其中所述调节为负调节。
14.根据权利要求1-13任一项的苯并间二氧杂环戊烯衍生物联合适用的乳化剂和可选的光保护剂化合物，作为植物中蛋白水解酶的活性或含量的调节剂的用途。
15.根据权利要求14的用途，其中所述乳化剂选自烷基芳基磺酸钙盐、脂肪酸聚乙二醇酯、烷基芳基聚乙二醇醚、脂肪醇聚乙二醇醚、环氧乙烷-环氧丙烷缩合物、烷基聚醚、山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐酯。
16.根据权利要求15的用途，其中所述乳化剂选自烷基芳基聚乙二醇醚和烷基芳基磺酸钙盐。
17.根据权利要求15的用途，其中所述光保护剂化合物选自苯并三唑，二苯甲酮和空间位阻胺。
18.根据权利要求17的用途，其中二苯甲酮选自2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮和2-羟基-4-辛基氧基二苯甲酮，且空间位阻胺选自癸二酸二(2，2，6，6-四甲基-4-哌啶基)酯和癸二酸二(1，2，2，6，6-五甲基-4-哌啶基)酯。
19.根据权利要求1-14的用途，包括用式II的苯并间二氧杂环戊烯衍生物以包括50～800克/公顷的浓度处理所述植物。
20.根据权利要求19的用途，其中所述浓度包含100～400克/公顷，更优选为200～350克/公顷。
21.根据权利要求20的用途，其特征在于其中在每个生长周期重复最多三次处理。
22.根据权利要求21的用途，其中在生长周期结束时至少实施一次处理。
23.根据权利要求19-22的用途，其中采用喷雾法实施所述处理。
全文摘要
本发明的目的在于苯并间二氧杂环戊烯衍生物作为植物中蛋白水解酶活性或含量调节剂的用途。所述新用途能增加植物天然或经诱导的抵抗力。
文档编号A01N43/02GK1633238SQ03803872
公开日2005年6月29日 申请日期2003年2月13日 优先权日2002年2月14日
发明者G·D·格莱尼琼斯, V·博扎塔 申请人:恩德拉股份公司