专利名称：免疫低下的啮齿类动物作为双色肿瘤模型的制作方法
技术领域：
本申请涉及免疫低下的转基因啮齿类动物(包括无胸腺裸鼠)的产生及用途，所述动物可被观察到在多处组织表达荧光蛋白，并保持它们的免疫低下的状态。所述啮齿类动物可用于进行细胞和组织的全身光学成像(wholebody optical imaging)，包括观察存在于所述啮齿类动物中的肿瘤及转移，尤其是带有两种不同发射光谱的荧光蛋白的肿瘤。
背景技术：
不存在底物但存在刺激性照射(stimulating radiation)时可发光的荧光蛋白已被用作研究工具多年。了解最多并最先被使用的此种蛋白是从维多利亚发光水母(Aequorea victoria)分离的绿色荧光蛋白(GFP)，但大量这种蛋白已从其他来源分离或通过合成获得，它们显示了多种发射峰值(emissionmaxima)，所以术语GFP已被用于描述在可见光的全部光谱，包括红，蓝，和黄中出现的蛋白。见例如Delagrave，S.等，BioTechnology(1995)13151-154；Heim，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)9112501-12504。已经成功修饰了若干生物体来表达这些荧光蛋白。所述生物体包括隐形秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)(Chalfie，M.等，Science(1994)263802-805)，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(Wang，S.等，Nature(1994)369400-403)，斑马鱼(zebrafish)(Peters，K.G.等，Dev.Biol.(1995)171252-257；Amsterdam，A.等，Dev.Biol.(1995)171123-129)，网柄菌(Dictyostelium)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)(Sheen，J.等，Plant J.(1995)8777-784；Hu，W.，FEBS Lett.(1995)36933-1-334)。
Okabe，等，FEBS Lett.(1997)407313-319，已将野生型GFP插入pCAGGS(包含鸡的β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒增强子，β-肌动蛋白内含子和牛的珠蛋白聚腺苷酸化信号-Niwa，H.，Gene(1991)108193-199)并产生了转基因小鼠系(Ikawa，M.，FEBS Lett.(1995)375125-128；和Ikawa，M.，Dev.Growth Diff；(1995)37455-459)。尽管观察到20种以上的这些转基因小鼠品系的肌肉和胰中发射出明亮的绿光，GFP表达不是普遍存在的，并且其他组织的光发射不是肉眼可见的。然而，当修饰的形式(EGFP)被用于这种表达系统时，转基因小鼠在整个机体(从植入前的胚胎到成熟阶段)中表达EGFP转基因。
与绿色的雄性精子受精的野生型卵子在两细胞阶段不是绿色的，但在随后的胚胎发生阶段之后变绿。新生体(Newborn)发绿色荧光。血管在携带EGFP的品系中被归类为‘明亮的’。这些动物的毛发不是绿色的。转基因小鼠除了毛发和红细胞外为均一的绿色。脑，肝，肾，肾上腺和睾丸，肺，肌肉，心脏，小肠，和脂肪组织，胸腺，脾和睾丸细胞在用蓝色激发光照射时发绿色荧光。
转基因小鼠品系除了EGFP表达量显著以外是正常的；因此EGFP不具有毒性。
本发明所述显示荧光的免疫低下的啮齿类动物的一个实施例见Yang，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2003)10014259-14262(十一月第25期)报道。
本文引用的文献不是为了承认它们是确认的现有技术。所有对于日期的陈述或关于文件内容的描述都是基于申请人能获得的信息，并非承认所述文件的日期和内容都是正确的。
发明概述出于未知原因，免疫低下的转基因啮齿类动物，如无胸腺的nu/nu小鼠是稀少的。本发明公开了在此种免疫低下的啮齿类动物中产生荧光蛋白的方法。所得的啮齿类动物可用于细胞和组织的体内成像，尤其作为移植的细胞或组织(如肿瘤)的受体，可以在转基因啮齿类动物的GFP表达细胞和组织的背景下观察所述细胞或组织。所以，移植的细胞或组织表达可以看得到的指示物(indicator)，例如但不限于另一种荧光蛋白。可通过与本发明转基因啮齿类动物的GFP表达细胞和组织背景相对比来观察移植的细胞或组织。所述的移植细胞或组织可包含肿瘤细胞或另外是癌性的细胞，从而可监测它们的生长性质和/或扩散。
也可用免疫低下的转基因啮齿类动物来筛选多种物质对于宿主啮齿类动物组织和移植细胞或组织之间相互作用的影响。所述物质的例子包括调控宿主-移植物相互作用或调控所移植的细胞或组织的生长和扩散的药物或侯选药物。
也可用所述啮齿类动物作为表达GFP的细胞或组织的来源来进一步研究和/或移植到其它动物或胚胎。可选的，此种移植是一系列移植，并且可以作为一个实施方案用来研究衰老。移植的细胞可包括胚胎干细胞和成年干细胞。
一实施方案中，表达GFP的啮齿类动物是无胸腺的nu/nu小鼠，它是通过将表达GFP的小鼠与nu/nu小鼠杂交来获得的。然后收集F1代并彼此杂交来产生后代，其中包括表达GFP的nu/nu小鼠。然后用来自F1×F1杂交的表达GFP的雄性和雌性nu/nu小鼠产生表达GFP的nu/nu小鼠后代。所得的小鼠可与不表达GFP的nu/nu小鼠杂交，来维持表达GFP的nu/nu小鼠。
用同样的策略可以得到其他免疫低下的啮齿类动物，如免疫低下的大鼠，其中免疫低下的品系与经修饰能表达荧光蛋白的正常品系杂交。
因此本发明一方面针对免疫低下的转基因啮齿类动物，其在基本所有组织中表达第一种荧光蛋白同时维持其免疫低下的表型。另一实施方案中，本发明针对移植了异体(heterologous)组织的此啮齿类动物，所述组织经修饰可表达发射光谱不同于第一种荧光蛋白的第二种荧光蛋白。另一方面，本发明针对转基因啮齿类动物，它在基本所有组织中表达第一种荧光蛋白的编码基因，并且它已经移植了表达第二种荧光蛋白的异体组织，该第二种荧光蛋白与所述第一种荧光蛋白发射光谱不同。
本发明另一方面涉及通过与啮齿类动物接触来分析药物对肿瘤宿主相互作用的影响的方法，该啮齿类动物表达第一种荧光蛋白且携带表达颜色不同的第二种荧光蛋白的肿瘤细胞，该方法包括使所述啮齿类动物与药物或方案(protocol)接触，并观察对宿主中包含的肿瘤细胞的作用。
附图简述
图1是植入免疫低下的小鼠后常位(orthotopically)生长的人结肠癌的全身成像。该肿瘤表达红色荧光蛋白，宿主显示出发绿光的荧光蛋白的全身表达。
图2A-2D显示了免疫低下的宿主中巨噬细胞的实时相互作用，所述巨噬细胞用绿色荧光蛋白标记，癌细胞用红色荧光标记。该图显示了初始接触(图2A)，吞没(engulfment)(2B)，巨噬细胞中吞没的癌细胞(2C)，及被巨噬细胞消化的癌细胞(2D)。
图3显示了本发明转基因小鼠与非转基因裸鼠的对比。
发明内容
本发明涉及表达GFP的免疫低下的啮齿类动物如无胸腺的nu/nu小鼠以及其制备方法和用途。所述啮齿类动物在基本所有组织中表达GFP，优选其水平使其发射的光可被肉眼看见。所述啮齿类动物是免疫低下的(例如无胸腺的nu/nu小鼠)，并可用作例如接受人肿瘤组织或其他异种移植物的宿主。
用与本文所述类似的技术，可得到表达GFP的其他免疫低下的啮齿类动物，如大鼠。
为了方便，术语“GFP”不仅用作呈现绿色的荧光蛋白的首字母缩写，而且一般用作能够应偶然的(incident)激发照射而发光的任何颜色的荧光蛋白的首字母缩写。从上下文可清楚知道GFP是用来表示一般意义还是用来指代事实上发射绿色荧光的蛋白。
这里所用的“GFP”指发射任意波长的荧光蛋白以及GFP和维多利亚水母绿色荧光蛋白的“增强”形式。移植细胞或组织带有可以观察到的指示物，如荧光染料，如本领域所公知的那样，通过进行选择，可以使移植细胞或组织中所用的荧光蛋白与宿主表达的荧光蛋白颜色不同。作为非限制的例子，如果绿色GFP在本发明的转基因啮齿类动物中表达，那么移植的细胞或组织可表达红色荧光蛋白(RFP)。
另外，在移植多种细胞或组织时，本发明提供用不同颜色进行标记的方法，使得可以观察和/或同步跟踪细胞或组织。其他荧光颜色的非限制性例子包括黄色，蓝色和红外(far-red)。其他荧光指示物的表达可选特异于细胞种类，基因或过程(processs)。提供此种特异性方法的非特异性例子包括，可操作连接编码荧光指示物的序列，使其受如下启动子的调节控制，所述启动子包括，细胞特异性启动子，对具体激活事件有反应的启动子，调节具体目标基因表达的启动子，和调节与目标细胞过程有关的基因产物表达的启动子。
也可用免疫低下的啮齿类动物作为表达GFP的细胞和/或组织的来源。所述组织的非限制性例子包括胚胎或胚胎组织；干细胞，和脑，肝，肾，肾上腺，睾丸(包括睾丸细胞)，肺，肌肉，心，小肠，卵巢和脾的细胞或组织以及脂肪组织。
对经过修饰包含与宿主荧光蛋白发射光谱不同的荧光蛋白的组织进行移植，也可用具有免疫能力的受试者在有限范围进行。为了在具有免疫能力的受试者中进行这方面的本发明，被移植的组织必须是同系的(syngeneic)，或者观察必须限于对免疫反应或其他反应，包括移植物排斥的短期研究。
本发明表达GFP的免疫低下的转基因啮齿类动物可用于，按照Yang等(“Visualizing Gene Expression by Whole-Body Fluorescence Imaging.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)9712278-12282)所述方式，观察基因表达，该文献描述了通过非侵入性技术观察完整动物中的转基因表达。此系统允许在完整活体小鼠的主要器官中快速观察转基因表达，它简单，迅速并且经济上可承受(eminently affordable)。在GFP转基因背景下，一种具有不同颜色的荧光蛋白在脑，肝，胰，前列腺和骨等的细胞内表达，并且它的荧光记录(encoded)在全身光学影像中。作为非限制的例子，较高分辨率的成像可用透视表面荧光解剖显微镜(trans-illuminated epifluorescence dissecting microscope)来进行，并且低分辨率的成像可采用荧光盒进行，并用经热电冷却的颜色电荷-关联(color charge-coupled)装置相机直接观察，或使用较简单的基于LED的装置。
本发明提供携带待测表达系统的转基因荧光啮齿类动物，其是将表达型载体携带的编码荧光蛋白的核酸(例如但不限于8×1010噬斑形成单位/ml的编码荧光蛋白的腺病毒表达系统，其在20-100μl PBS和10％甘油中)直接注射到组织如脑，肝，胰，前列腺，或骨髓中来提供的。注射后5-8小时内，组织如脑中表达的GFP的荧光变为可以观察，以视频速度(video rates)记录全身成像。GFP的荧光持续增加至少12小时，并在组织如肝中保持可检测状态最多达4个月。实时记录可以在不需要外源对比物质(其中载体编码的GFP与啮齿类动物组织中表达的GFP不同)，放射性底物，或长时期加工的条件下进行。此方法仅需将表达的待测编码序列或启动子与载体携带的GFP融合或可操作连接，来研究适当标记的基因在相对不透明的生物体，或如本文一样，在荧光啮齿类动物中的治疗和诊断潜力。
另一方面，也可按Yang等(″Whole-Body Optical Imaging of GreenFluorescent Protein-Expressing Tumors and Metastases，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)971206-1211)所述方式给转基因啮齿类动物成像并应用，该文献描述了全身光学成像系统。此种系统首次可在完整动物内连续观察监控细胞生长和扩散，包括被移植的(及任选的癌性的)细胞或组织所表现的那些，它们在本发明中用表达的具有不同颜色的GFP标记。
本发明优选实施方案中，荧光啮齿类动物包含在活体啮齿类动物中生长并转移的被移植的发荧光肿瘤。这些肿瘤的非限制例子包括如Yang等(如上述)所述稳定表达很高水平GFP的人和啮齿类动物的肿瘤。所用的肿瘤表达除啮齿类宿主中表达的GFP以外的GFP。如上指出，本发明免疫低下的荧光啮齿类动物优选此方法，从而使对宿主的双标记能维持很长时间；然而，对于短期研究或用同系肿瘤来做的研究，例如将啮齿类动物肿瘤植入啮齿类动物，甚至可以用具有免疫能力的转基因荧光啮齿类动物。
作为非限制的例子，将B16F0-GFP小鼠的黑色素瘤细胞注射到6周龄的免疫低下的荧光啮齿类动物的尾静脉或门静脉。用全身光学成像来显示转移的损伤如在脑，肝和骨中产生的损伤。B16F0-GFP细胞易于观察，从而可以在这些器官的每一个中实时、定量测量肿瘤生长。
另一非限制的例子中，可通过手术常位植入AC3488-GFP人结肠癌。用全身光学成像来实时显示原发结肠癌的生长及其在肝和骨骼中的转移损伤。
本发明也提供用免疫低下的荧光啮齿类动物来鉴定或筛选癌症生长的调控物质的方法。一实施方案中，这些方法可用来鉴定潜在的化疗物质的抑制作用。所以，本发明在免疫低下的荧光啮齿类动物中的肿瘤发展模型是通过植入，优选常位植入肿瘤的癌细胞或完整节片(intact portion)来建立的，该肿瘤表达与转基因宿主所提供的背景的发射波长不同的荧光蛋白。一旦建立了模型，给予宿主侯选化疗物质或方案，并直接观察其对肿瘤发展和转移的影响。
也可用免疫低下的荧光啮齿类动物获得有关血管生成事件的影像，方法按Yang等(″Whole-Body and Intravital Optical Imaging of Angiogenesis inOrthotopically Implanted Tumors，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2001)982616-2621)所述。所以本发明也提供了肿瘤诱导的血管形成的分析方法。这些方法通过将用GFP标记的肿瘤植入荧光啮齿类动物，可以作为测量血管生成事件的常位移植模型的一种适应。使用与宿主GFP发出的颜色不同的GFP，通过体内(intravitally)检查或通过全身发光(luminence)实时检查，宿主的表达GFP的毛细血管对比肿瘤的荧光清楚可见。这优选用人的肿瘤来进行，从而可对常位植入的人胰腺肿瘤进行活体成像，以此显示，在本发明免疫低下且被标记的宿主中，在原发和转移位置经血管生成事件而生成的毛细血管。在19天内，在单个啮齿动物中，对常位生长的人前列腺肿瘤做阶段性体内成像，可确定血管生成事件的定量时间变化。
例如，通过将发荧光的Lewis肺癌细胞注射到足垫的皮下位置，可显示肿瘤血管生成事件的全身光学成像。所述足垫相对透明，带有相对较少的血管，从而可对完整动物中的肿瘤血管生成(如通过增加毛细血管密度而实施的血管生成)进行定量成像。
另一实施方案中，表达GFP的人乳腺肿瘤MDA-MB-435可常位植入脂肪垫，然后对其成像来线性检测血管密度在延长的时间段(如最长达到或超过20周)内的改变，尤其是增加。也可用这些有效的并且与临床相关的血管生成型裸鼠模型，实时体内评估在生理微环境中抑制或促进肿瘤血管生成的物质，其可如上述，通过观察所述物质对血管生成的影响来进行。
另一方面，本发明啮齿类动物可用与Yang等(″Direct External Imaging ofNascent Cancer，Tumor Progression，Angiogenesis，and Metastasis on InternalOrgans in the Fluorescent Orthotopic Model，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2002)993824-3829)所述类似的方式来应用，来克服外部成像灵敏度的局限，该局限是由于干扰组织(intervening tissue)，最尤其是皮肤使光散射造成的。因此本发明提供在光通路中造成皮瓣(skin-flap)来明显降低信号衰减并提高检测灵敏度很多倍。组织的可观察深度明显增加，并且现在可清楚观察很多以前隐藏的肿瘤。
所述皮瓣可以可逆地打开和闭合。一般在麻醉动物后，在皮肤上作弧形切口并剥离皮下结缔组织以便使皮瓣游离。可通过缝合来闭合该瓣。因此本发明使得可以对于肿瘤模型系统的内在器官进行观察。
直接通过打开的皮瓣观察标记的肿瘤细胞的能力很大程度地增强了本发明模型系统的灵敏度和分辨率。所述模型可简单用于监测状况进展或用作工具来评估潜在的治疗剂(therapeutics)，以及评估效果，所述效果有可能比不治疗导致更差的结果。本发明中，提供了化合物和/或方案来测试动物并与不存在所述化合物和/或方案的对照比较。在这些实验条件存在时的肿瘤发展、血管生成和/或转移的增强，表明所述化合物和/或方案对受试者有害；类似地，对任何这些性质的抑制可以导致将所述化合物和/或方案鉴定为潜在的治疗剂。
一个实施方案中，将表达荧光蛋白的单个的肿瘤细胞通过头皮皮瓣接种在脑影像上。代表少数细胞的肺肿瘤微聚焦(microfoci)通过胸壁上的皮瓣来观察，而对侧的(contralateral)微转移通过相应的皮瓣来成像。胰的肿瘤及它们的血管生成性微血管借助于腹膜壁皮瓣成像。肝部的皮瓣可以允许对源于常位植入肿瘤的生理相关微转移成像。由门内注射(intraportal injection)造成的肝部单个的肿瘤细胞也可检测到。表达两种不同的GFP的细胞或组织，如宿主组织与移植组织或两种移植组织，也可通过使用皮瓣来观察。尤其优选的是使用下腹部皮瓣来观察前列腺组织或周围区域。
为带有GFP的移植物提供细胞或组织的方法是已知的。可用标准方法提供带有一种或更多种荧光蛋白的表达系统的肿瘤细胞。可将所述细胞体外转导并在体外或体内生长成肿瘤，再将所得肿瘤移植到模型受试者。所述细胞可被注射或可通过手术移植。当需要肿瘤进展的模型时，优选外科常位移植。但也可使用其他提供带有经修饰的肿瘤细胞的模型的方法，所述经修饰的肿瘤细胞稳定表达荧光蛋白。另外，可提供带有病毒载体，尤其是逆转录病毒载体的本发明携带内源性肿瘤或引入的肿瘤的啮齿类动物来表达GFP蛋白，该蛋白发出的光与宿主内已存在的肿瘤被感染后该宿主所发出的光不同。这尤其与易感染肿瘤的哺乳动物模型相关，所述模型如美国专利4,736,866所述的“癌小鼠(oncomouse)”。此载体优选被局部地并直接地引入已经存在的肿瘤。
一般，依赖于对荧光发射的观察的任何关于肿瘤发展、血管生成和/或转移的模型可采用本发明荧光啮齿类动物和方法。
很多例子中，用单色来观察单一肿瘤的转移。但是本发明方法包括同时观察两种或更多肿瘤，其每一个都用不同颜色的荧光蛋白来标记。用此方法，不仅能对多个肿瘤的发展进行观察，而且可直接观察到每种肿瘤对其他肿瘤的影响或干扰。
本发明的方法有多项优点。首先，增强的灵敏度允许在荧光宿主细胞和组织的背景中观察仅一个或两个移植细胞。第二，可直接观察血管生成，这对于评估提议的化合物和方案的治疗有效性极为重要。第三，可以同时观察多个移植组织(如肿瘤)。这一点特别重要，因为各个组织或肿瘤之间有干扰现象。由于可使用多种不同颜色，因而可直接观察不同组织或肿瘤的相互作用。第四，因为可以在免疫低下的荧光啮齿类动物中在相当长时间内进行观察，故可区分活跃增殖的细胞和休眠的细胞。因此，用本发明方法可确定休眠细胞的存在。
另一方面，可给荧光宿主注射可检测的，优选可视的化合物，从而在裸鼠组织的GFP背景下产生图像。非限制的例子是，将可视的指示物，如染料注射到本发明小鼠的血流中，以便观察所有或部分的循环系统。这尤其合适于啮齿动物的红细胞不表达可视GFP的情况，这时血流不发射可检测的光。
如下例子是为了举例说明本发明而不是为了限制。
实施例1产生表达GFP的裸鼠C-57 B6-GFP小鼠(Okabe，M.等，FEBS Lett(1997)467313-319)与nu/nu小鼠杂交。所述C-57/B6-GFP小鼠得自Osaka大学的微生物疾病研究院(Research Institute for Microbial Diseases)。这些小鼠表达维多利亚发光水母(A.victoria)GFP，其受鸡beta-肌动蛋白启动子和CMV增强子控制。除红细胞及毛发以外的所有组织在激发光下都发绿色荧光。
收集F1代并彼此杂交。得到一雌一雄两只稀有的GFP nu/nu小鼠。让GFP nu/nu雄鼠和GFP nu/nu雌鼠彼此杂交得到一窝6只GFP nu/nu小鼠。
GFP nu/nu雄鼠与雌性nu/nu非GFP小鼠杂交。得到九只nu/nu裸鼠后代。它们均在组织中表达荧光。见图3，它对比了非GFP nu/nu和GFP nu/nu小鼠。
实施例2产生带红色荧光蛋白的肿瘤将红色荧光蛋白(RFP)，DsRed2(Clontech)插入pLNCX2(Clontech)的EglI和NotI位点。
将饱和量的所得载体pLNCX2-DsRed2与DOTAP试剂(BoehringerMannheim)和汇合度70％的PT67包装细胞的沉淀混合物温育18小时。PT67细胞是NIH 3T3-衍生且表达10A1病毒包膜的包装细胞系，它在补充了10％热灭活FBS的DMEM(Irvine Scientific)中培养。此时补充新鲜培养基，在转染后48小时，通过荧光显微镜检查细胞。为选择产生高滴度逆转录病毒上清、并发明亮荧光的细胞，将表达RFP的包装细胞在存在500-2,000μg/ml逐步增加的G418(Life Technologies，Grand Island，NY)时培养7天。
将PT67细胞的逆转录病毒上清和RPMI 1640或含10％FBS(GeminiBiological Products)的其他培养基(GIBCO)的1∶1沉淀混合物与汇合度20％的所需肿瘤细胞系温育72小时。此时补充新鲜培养基，用胰蛋白酶/EDTA收获肿瘤细胞并以比率1∶15在选择性培养基中再次培养，该选择性培养基包含50μg/ml的G418。为选择发明亮荧光的细胞，将G418的水平逐步增加到800μg/ml。用胰蛋白酶/EDTA和克隆柱(Bel-Art Products)分离表达RFP的克隆，并用常用培养方法在无选择性物质时将其扩增并转移。
如此获得的肿瘤细胞为红色荧光细胞，包括如下啮齿类动物B16F0黑色素瘤细胞；小鼠MMT060562乳房肿瘤细胞；小鼠Dunning前列腺癌细胞；人PC-3前列腺癌细胞；和人HCT-116结肠癌细胞。
实施例3肿瘤进展的双标记模型HCT-116-RFP-即标记了红色荧光蛋白的人结肠癌细胞用胰蛋白酶消化法收获，用冷的无血清培养基洗三次并用无血清RPMI培养基1640重悬。通过左下腹切口来暴露结肠，将所述细胞在收获40分钟内注射到实施例1制备的6周龄转基因雌性GFP裸鼠中。用25μl注射器将50μl的106HCT-116-RFP细胞注射到降结肠的浆膜以下。腹壁的切口用6-0外科手术缝线进行单层缝合。手术过程中所述动物一直被克他命(ketamine)麻醉。
在用470nm的纤维光学发光(Lightools Research，Encinitas，CA)所照射的荧光盒子中进行全身成像。通过长通滤过器(long-pass filter)GG475(ChromaTechnology，Brattleboro，VT)在Hamamatsu C5810三-片(three-chip)冷色CCD相机(Hamamatsu Photonics，Bridgewater，NJ.)上收集发射的荧光。直接在IBMPC上捕捉1,024/724像素的高分辨率影像，用Image Pro Plus 3.1软件(MediaCybernetics，Silver Spring，MD)对影像的对比度和亮度进行加工并分析。
图1显示了植入后10周常位生长的HCT-116-RFP人结肠癌的全身影像。该影像用CCD相机在荧光盒子中获得。如所示，此系统可容易地区分肿瘤和宿主。
实施例4巨噬细胞与前列腺肿瘤的相互作用用胰蛋白酶消化法收获PC-3-RFP，即标记了红色荧光蛋白的人前列腺癌细胞，用冷的含血清培养基洗三次，并置于冰上。在40分钟内将30μl的106个细胞注射到实施例1中获得的免疫低下的小鼠的膀胱和前列腺中，其过程如下作下腹中线切口，将膀胱和前列腺暴露；注射后用6-0外科手术缝线将切口闭合，所述动物一直被异氟烷(isoflurane)麻醉。
为了观察，将新鲜组织切成大约1mm3的片并压到玻片上作荧光显微镜检。在显微观察中，用装配了100-W汞灯电源的Olympus BH 2-RFCA荧光显微镜同时观察GFP和RFP的荧光。通过D425/60集束滤过器(bind passfilter)，470 DCXR二向色反射镜产生激发光。通过长通滤过器GG475(ChromaTechnology)收集发射的荧光。用Hamamatsu C5810三-片冷色CCR相机(Hamamatsu Photonics)捕捉1,024/724像素的高分辨率影像并直接储存在IBM PC中。用Image Pro Plus 3.1软件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)加工影像的对比度和亮度并分析。
通过转基因裸鼠发出的绿色荧光，可以显示巨噬细胞与肿瘤细胞的相互作用，见图2。植入35天后拍摄了此图像。A图显示了接触RFP癌细胞的宿主GFP巨噬细胞；B图显示了GFP巨噬细胞正在吞没RFP癌细胞；C图显示了被GFP巨噬细胞吞没的RFP癌细胞，D图显示了被巨噬细胞最后消化了的RFP癌细胞。
实施例5研究发出荧光、并具有免疫能力的小鼠当应用同系的移植物时，用双色成像对具有免疫能力的受试者进行短期研究。在Okabe描述的鼠模型中产生了C57/B6-GFP小鼠。用106个表达RFP的小鼠B16F0黑色素瘤细胞，106个表达RFP的小鼠MMT060562乳房肿瘤细胞和106个表达RFP的Dunning(大鼠)前列腺癌细胞进行研究。用这些技术，可在注射B16F10-RFP黑色素瘤细胞后3周观察到活体肿瘤组织中的血管生成，并且也可观察到宿主树突细胞和新鲜肿瘤组织中的肿瘤细胞的相互作用。在乳腺癌模型中可观察到淋巴细胞浸润。
因此可以观察到肿瘤血管发生早期事件以及免疫系统与移植肿瘤相互作用的双色影像。
权利要求
1.免疫低下的转基因啮齿类动物，其在基本所有组织中表达第一种荧光蛋白，并维持其免疫低下的表型。
2.权利要求1的啮齿类动物，其为小鼠。
3.权利要求2的小鼠，其为nu/nu小鼠。
4.权利要求1的啮齿类动物，其移植了异体组织，所述组织被修饰以表达第二种荧光蛋白，该第二种荧光蛋白与第一种荧光蛋白发射光谱不同。
5.权利要求4的啮齿类动物，其中所述第一种荧光蛋白为绿色，且第二种荧光蛋白为红色。
6.权利要求4的啮齿类动物，其中所述异体组织包含肿瘤细胞。
7.权利要求6的啮齿类动物，其中所述肿瘤细胞被常位移植到所述啮齿类动物中。
8.权利要求7的啮齿类动物，其中所述肿瘤细胞是肿瘤的完整节片。
9.药物对肿瘤-宿主相互作用的影响的分析方法，其包括将权利要求6的啮齿类动物与所述药物接触，通过观察所述第一种和第二种荧光蛋白的发射获得肿瘤-宿主细胞相互作用的影像，并将所得影像与不接触所述药物的啮齿类动物比较。
10.权利要求9的方法，其中所述观察是获得完整动物活体的全身影像。
11.转基因啮齿类动物，其在基本所有组织中表达第一种荧光蛋白的编码基因，并且其已经移植了表达与所述第一种荧光蛋白发射光谱不同的第二种荧光蛋白的异体组织。
12.权利要求11的啮齿类动物，其为小鼠。
13.权利要求11的啮齿类动物，其中所述第一种荧光蛋白为绿色且第二种荧光蛋白为红色。
14.权利要求11的啮齿类动物，其中所述异体组织包含同系的肿瘤细胞。
15.权利要求14的啮齿类动物，其中所述肿瘤细胞被常位移植到所述啮齿类动物中。
16.权利要求15的啮齿类动物，其中所述肿瘤细胞是肿瘤的完整节片。
17.药物对肿瘤-宿主相互作用的影响的分析方法，其包括将权利要求11的啮齿类动物与所述药物接触，通过观察所述第一种和第二种荧光蛋白的发射获得肿瘤-宿主细胞相互作用的影像，并将所得影像与不接触所述药物的啮齿类动物比较。
18.权利要求17的方法，所述观察是获得完整动物活体的全身影像。
19.繁殖表达第一种荧光蛋白的细胞或组织的方法，其包括从权利要求1的啮齿类动物分离组织并将它们移植到另一个动物或胚胎中。
20.权利要求19的方法，其还包括一系列的再分离和再移植，所述再移植是将所述组织移植到另一动物或胚胎中。
全文摘要
本发明描述免疫低下的啮齿类动物，其经过修饰在基本所有组织中表达荧光蛋白。这些啮齿类动物可用作基因表达，肿瘤进展和血管生成的模型。本发明也提供了模型系统，其中发射第一种颜色的荧光的异体组织被移植到宿主，该宿主经过修饰在基本所有组织中发射第二种颜色的荧光。
文档编号A01K67/027GK1947006SQ200480009199
公开日2007年4月11日 申请日期2004年2月9日 优先权日2003年2月7日
发明者杨萌, 埃利吉奥·雷诺斯, 徐明旭, 姜平 申请人:抗癌公司